对隐色孔雀绿和孔雀石绿进行免疫测定的方法和试剂盒技术

本发明专利技术提供半抗原、包含与赋予抗原性的载体材料偶联的所述半抗原的免疫原、包含与标记物结合的所述半抗原的偶联物、以及对抗这样的免疫原并能与隐色孔雀绿和孔雀石绿结合的抗体。

【技术实现步骤摘要】
对隐色孔雀绿和孔雀石绿进行免疫测定的方法和试剂盒 专利
本专利技术涉及新的免疫原、抗体和偶联物，它们用于检测和/或测定隐色孔雀绿(leucomalachite Green)和孔雀石绿(Malachite Green)的免疫测定。本发 明也涉及用于检测或测定隐色孔雀绿和孔雀石绿的免疫测定方法和试剂 盒。"检测(detecting)"是指定性分析隐色孔雀绿和/或孔雀石绿在样品中的 存在或不存在。"测定(determining)"是指定量分析隐色孔雀绿和/或孔雀石 绿在样品中的量。专利技术背景孔雀石绿是养鱼中使用的外用驱虫剂、杀真菌剂和杀菌剂。然而，它 却是潜在的致癌剂、致突变剂和致畸变剂。自从1933年以来，已经认识到 在可食用鱼类(例如鲑鱼(trout)和鳗鱼(eel))中的非法和威胁公众安全的使 用。吸收后，孔雀石绿迅速地被还原为其无发色团的代谢物隐色孔雀绿， 其是在受处理的水生动物的药物残留分析中检测到的普遍的残留物。孔雀 石绿和隐色孔雀绿具有下列结构式孔雀石绿 隐色孔雀绿。最近孔雀石绿和隐色孔雀绿受到残留物分析者的高度观注，因为在养 殖的大西洋鲑鱼和鳕(hake)鱼中发现了它们(参见，对食物和饲料的每周欧盟 快速预警才艮告2003/2004(Weekly EC Rapid Alert Reports for Food and Feed 2003/2004))。用于孔雀石绿和隐色孔雀绿测定的方法相当有限。孔雀石绿具有光谱 可见光区域(580-620nm)的发色团，这种发色团在孔雀石#录的分析中相当有 帮助。然而，隐色孔雀绿在260-270nm具有入max,使得其在相同的条件下 难于分析。已经采用了很多方法来避免该问题。 一种方法使用过柱后氧化 的步骤，在HPLC分离后和检测前，将隐色孔雀绿氧化为孔雀石绿，以允 许在更高的波长进行检测。通常，将分散于Celite(商品名)的铅氧化物或其 本身包装放入短柱中使用。在另一变通方法中，Klein等人(E. Klein， M. Edelhaeuser和R. Lippold， Dtsch. Lebensm,Rundsch.， 1991， 87, 350)使用二氧 化铅进行过柱前的氧化，测定的孔雀石绿为母体和隐色孔雀绿的总和。已 使用电化学氧化作为二氧化铅的替代物。检测孔雀石绿和隐色孔雀绿的可 选择的方法是使用LC-MS。粒子束LC-MS已经用于在鲶鱼(catfish)中确认 孔雀石绿。欧洲最4氐要求的执4亍才及卩艮(European minimum requried performane limit, MRPL),残留物实验室的定性参数，设定孔雀石绿和隐色孔雀绿的总量为2 ju g/kg。最近，气相色镨质语(GC-MS)和其它液相色镨串连质镨(LC-MS/MS) 方法已经出现于第五届欧洲残留物会议(Euro Residue Conference)中。 GC-MS和LC-MS方法都具有良好的表现，能以远低于设定MRPL的浓度 可靠地检测和鉴定这些残留物。特异性结合反应，例如抗体-抗原相互作用，已经在免疫测定中广泛使 用，用来检测组织提取物中存在的多种物质。因此，例如放射性免疫测定 (RIA)可用于孔雀石绿和隐色孔雀绿的测定。放射性免疫测定非常敏感，但 却需要放射性核素示踪物，例如1251和&。目前还没有已知用于孔雀石绿 和隐色孔雀绿的RIA。酶联免疫吸附测定(ELISA)是非放射性的方法，可选 用该方法对孔雀石绿和隐色孔雀绿进行定性和定量测定。最近，用于孔雀 石绿的测试试剂盒已经可以商业性获得。Bioo Scientific生产孔雀石绿 ELISA测试试剂盒，其设计为仅检测孔雀石绿。这表明Bioo试剂盒包含抗 基于孔雀石绿的免疫原的抗体，不像本专利技术使用基于隐色孔雀绿的免疫原。 这得到Bioo Scientific提供的信息的进一步支持，该信息给出对隐色孔雀绿 的交叉反应性为1%。由于孔雀石绿快速和广泛地代谢为隐色孔雀绿，BiooScientific免疫测定要求在抗原-抗体结合之前引入样品预处理步骤，使隐色 孔雀绿转化为孔雀石绿。这使所述免疫测定因使用额外的步骤而比本专利技术 更费时以及更易产生试验误差。在第一方面，本专利技术提供包含隐色孔雀绿的免疫原，其中隐色孔雀绿 通过交联剂与赋予抗原性的载体材料偶联、且该交联剂从隐色孔雀绿的未 取代苯环的对位、邻位或间位伸出。本专利技术也提供对抗这样的免疫原的抗 体。此外，本专利技术涉及包含隐色孔雀绿的偶联物，其中隐色孔雀绿通过交 联剂与可检测的标记物共价结合、且该交联剂从隐色孔雀绿的未取代苯环 的对位、邻位或间位伸出。本专利技术的免疫原和偶联物均可得自于下式I的半抗原，其中交联剂(该 交联剂包含-X-Y-Z)从隐色孔雀绿的未取代苯环的对位、邻位或间位伸出其中X是第一个二价连接，Y是第二个二价连接，Z是可与赋予抗原性的 载体材料偶联(产生免疫原)或可与可检测的标记物偶联(产生偶联物)的反应 基团。优选，交联剂从隐色孔雀绿的未取代苯环的对位伸出。优选，X是选自O、 S和N的杂原子，最优选在免疫原的情况中X是O 原子，最优选在偶联物的情况中X是N原子。优选，Y是d.u),更优选C2.6，最优选C3，取代或未取代的直链，饱和亚烷基部分(alkylene moiety),或亚芳基部分(arylene moiety)。 一个合适的 取代基是羰基(CO)。有利的是，z(与赋予抗原性的载体材料偶联(产生免疫原)或与可检测的 标记物偶联(产生偶联物)之前)选自羧酸、二疏代吡啶基(dithiopyridyl)、顺丁 烯二酰亚胺、氨基、羟基、巯基(thiol)、硫酯或醛部分。与赋予抗原性的载专利技术概述"式I体材料偶联之前，Z是羧酸(COOH)时，羟基的氧原子首先与DCC结合，然 后与NHS结合，形成带有强效离去基团的酯。通过赋予抗原性的栽体材料 上的游离氨基，对上述酯的羰基(C-O)进行亲核攻击，导致酰胺键和形成所 期望的免疫原。当Z在与可检测的标记物偶联前是巯基(在石危酯的情形下， 该琉基通过在碱性条件下水解而形成)时，有该巯基和BrCH2C(0)NH-HRP 参与的亲核取代反应导致溴被巯基取代，并形成所期望的偶联物。本领域 读者可参考Bioconjugate Techniques G. Hermanson, ed., Academic Press, 1996， 785 pp.(其内容以其全部在此引入)中关于Z反应基团和赋予抗原性的载体 材料或可检测的标记物之间相互作用的详细描述，其中Z是选自羧酸、二 硫代吡啶基、顺丁烯二酰亚胺、氨基、羟基、巯基、硫酯或醛部分所组成 的组中的剩余者(remainder)。最有利的是，Z(与赋予抗原性的载体材料偶联 (产生免疫原)之前)是羧酸(COOH)部分。最有利的是，Z(与可检测的标记物 偶联(产生偶联物)之前)是巯基或硫酯部分。最有利的是，半抗原是对-(3-羧基丙氧基)隐色孔雀绿(半抗原A)。半抗 原A的结构式显示于附图说明图1。优选，免疫原是与赋予抗原性的材料偶联的对-(3-羧基丙氧基)隐色孔雀 绿，其中所述材料可以是选自牛血清白蛋白(BSA)和牛曱状腺球蛋白(BTG)。孔雀石绿的半抗原衍生物(以及相应的免疫本文档来自技高网...

【技术保护点】
免疫原，其包含隐色孔雀绿且该隐色孔雀绿利用交联剂与赋予抗原性的载体材料偶联，其中所述交联剂从隐色孔雀绿的未取代苯环的对位、邻位或间位伸出。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：埃尔奥亚特本奇克，罗伯特I麦康奈尔，斯蒂芬P菲茨杰拉德，安德鲁P劳里，
申请(专利权)人：兰多克斯实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]