一种凝血活酶试剂，包含：（ｉ）活化的ｓＴＦ，（ｉｉ）金属螯合脂质，（ｉｉｉ）金属离子，和（ｉｖ）磷脂。活化的ｓＴＦ优选包含ＴＦ的细胞外结构域和具有至少２个，更优选２－１０个组氨酸残基的寡聚组氨酸部分。优选地，所述组氨酸残基是连续的。金属结合结构域例如寡聚组氨酸标签连接至ｓＴＦ的Ｃ－末端允许蛋白质结合含有金属螯合脂质的磷脂泡囊。所述活化ｓＴＦ和金属螯合脂质的金属复合物具有ｓＴＦ的所有期望的表达、处理和溶解性特性，并在血浆凝结实验中表现出可与重脂质化ｒＴＦ相比较的促凝血活性。而且，发现在有些情况下，Ｎｉ－脂质本身是促凝血的，甚至在不存在活化ｓＴＦ的情况下。进一步的研究表明，Ｎｉ－脂质是血液凝结的接触途径的有效活化剂。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】凝血剂 对相关申请的引用本申请要求2005年2月16日提交的名称为"通用的促凝血剂，，的美国 临时申请No. 60/653,695的权益，通过引用将其全部内容合并在此，除了与 本申请不一致之处。联邦政府赞助的研究或开发本申请得到以下研究拨款和合同的部分资助国家卫生研究院(NHLBI) 拨款No.ROl HL47104。美国政府在这项专利技术中可以享有某些权利。背景仅仅列出凝结因子和Ca^的凝结级联的示意图在附图说明图15中示出。在该图中，各种凝结因子通过它们的罗马数字来指明(即，因子vn通过vn来指 明)。当血液和某些人工表面之间发生接触时，血液凝固的内在途径(也称为 接触途径)被启动。在发生引起组织因子(也鉴定为因子III)暴露的血管损伤 时，血液凝固的外在途径(也称为组织因子途径)被启动。点线箭头代表在外在和内在途径之间的交叉点。这两个途径在因子X向Xa的活化之处汇合。 因子Xa在因子VII到Vila的进一步活化中起到作用。活性的因子Xa水解 并活化凝血酶原成为凝血酶。然后凝血酶活化因子XI、 VIII和V,促进级 联。最终，凝血酶的作用是将纤维蛋白原转化为血纤蛋白，其形成凝块。组织因子是一种细胞表面蛋白，其在正常的止血和各种血栓性的疾病 中是触发血液凝固系统的原因。组织因子通过紧密地结合以及变构地 活化凝结因子VIIa(VIIa)来实现这一点，所述凝结因子VIIa(VIIa)是一种血 浆丝氨酸蛋白酶。组织因子和VIIa的1:1复合物(TF:VIIa)是血液凝固的组 织因子途径中的第一个酶，Vila作为催化亚单位起作用、组织因子作为调 节亚单位起作用。当TF:VIIa经由有限的蛋白水解作用活化两种血浆丝氨酸 蛋白酶酶原(凝血因子IX和X)时，凝结级联由此被触发，最终引起由血纤 蛋白凝块和活化的血小板组成的止血栓塞的形成。野生型人类组织因子(TF)是261或263个氨基酸的单多肽链，含有四 个半胱氨酸残基，其形成两个二硫键。它是一种I型整合膜蛋白，是指它 的N-末端位于细胞外侧，它的C-末端在细胞质内。TF具有单个3争膜结构 域，其将蛋白质锚定在质膜中。TF的细胞外结构域是结合于并且变构地活 化Vila的部分。TF的细胞质结构域对于TF促凝血活性是可有可无的，但 是TF的膜锚定对于完整的TF活性是必需的。已经通过重组手段产生了 既不具有跨膜结构域也不具有细胞质结构域的截短的、可溶形式的组织因 子(sTF)。不同于膜锚定TF， sTF是高度水溶性的。虽然sTF保持 了结合Vila并且变构地活化它的能力(通过小的、肽基-酰胺底物的水解来 测量的)，sTF具有大大地降低的促凝血活性。已经显示了， sTF 在支持酶原因子VII向活性酶形式Vila转化方面是选4奪性缺陷的。(促 进因子VII向VIIa转变的能力是TF的重要功能之一。这种功能的丧失 解释了 sTF对正常人类血浆的低促凝血活性)。 sTF的独特的缺陷已经被 利用来创建凝结分析，所述分析定量血浆Vila水平而不受酶原因子VII的 干扰。另一方面，sTF促凝血活性中的这种缺陷意味着在标准的凝结分 析如凝血酶原时间(PT)分析中它不能替代膜锚定的TF。由于sTF的溶解性质，相比膜锚定的TF, sTF显著地更容易表达、纯 化和处理。在用于产生sTF的某些表达系统中，sTF的分泌被靶向Eco// 的周质间隙， 一种容许形成二硫键的氧化环境。通过渗透休克容易地从 Eco/Z的周质间隙释放sTF，此外，sTF不需要任何特殊条件来维持水溶性。 利用工程化到sTF的N-末端上的肽表位(HPC4表位)，sTF可以通过免疫亲 和层析从五.co"释放物中纯化。在存在钙离子的情况下，sTF-HPC4融合 蛋白以高亲和性与固定的HPC4抗体结合。在洗涤免疫亲和珠子之后，使 用EDTA洗脱纯化的sTF。表达产量是每升Eco//培养物大约20 mg sTF。与sTF相比，重组的、膜锚定的组织因子(rTF)在Eco//细胞中以低得 多的水平表达，在纯化过程的所有阶段，rTF更难以处理。用于sTF的相同 的目标载体被用于rTF的Eco//表达。(它将rTF的细胞外结构域靶向周质 间隙，而膜锚定物保持嵌入在Eco"的内膜中。)从Eco"提取rTF需要细 菌的完全溶解。还需要使用洗涤剂，用于从所述膜提取rTF，以及保持rTF 溶解。rTF的纯化使用与纯化sTF相同的免疫亲和层析方法来实现，不同之处是洗涤剂(一般地，0.1% Triton X-100)被加入到rTF所暴露的所有溶液中。 在五.co〃表达系统中rTF的表达产量是每升Eco/!'培养物大约1 mg,其比 sTF的产量至少低20倍。凝血酶原时间(PT)测试;陂广泛用于监视通过香豆素的口腔抗凝治疗， 作为血液凝固系统的一般性筛选测试，并作为特定因子分析的基础。PT测原)、VII和X的血浆水平，并取决于两种非维生素K依赖性蛋白质一一因 子V和纤维蛋白原一一的水平。香豆素治疗对抗维生素K羧化酶/还原酶循 环，因而抑制谷氨酸残基向Y-羧基谷氨酸的翻译后转变。维生素K依赖性 凝结因子在它们的Gla结构域中含有必需的Y-羧基谷氨酸残基。接受香豆 素治疗的患者将因而产生具有降低的促凝血活性的低度羧基化的维生素K 依赖性凝结因子。这延长了PT时间，主要由于因子II、 VII和X的水平的 降低。使用香豆素的成功的口腔抗凝治疗需要小心监视患者的PT时间，以 实现有效水平的抗凝作用同时最小化出血并发症(由Hirsh等人综述)。PT测试是通过将柠檬酸化的血浆样品与凝血活酶试剂混合以及测量形 成凝块的时间而进行的。凝血活酶试剂中的活性成分是组织因子。在1990 年纯化的TF变为可获得之前，凝血活酶试剂由人类或动物来源的相对粗的 组织提取液制成。近年来，已经使用高度纯化的rTF来制备凝血活酶试剂， 其完全由限定的成分组成。重组凝血活酶试剂潜在地优于组织衍生 的试剂，因为它们的组成以及由此的它们的性质更容易由生产厂家来控制。 为了制备重组的凝血活酶试剂，将rTF重构到由合适的磷脂混合物组成的 单层磷脂泡嚢内。(TF重构到磷脂泡嚢中有时称为"重脂质化(relipidation )"。) 为了在血液凝结中有效地起作用，所述泡嚢必须含有具有净负电荷的一些 磷脂，丝氨酸磷脂是最有效的带负电磷脂。各种方法可以用于将rTF掺入 到磷脂泡嚢中(由Smith和Morrissey讨论)。触发血液凝固的第二种途径是内在的或接触途径。当血浆接触某些人 工的表面，例如玻璃、硅土或高岭土时，这种非组织因子依赖性途径被活 化。当激肽释放酶原、高分子量激肽原和因子XII暴露于带负电的表面时， 这种接触途径被启动。这引起起始复合物的形成，所述起始复合物致使因 子XII经由有限的蛋白水解作用转变成它的活性酶形式，因子XIIa。然后因子Xlla在4丐依赖性反应中将因子XI转化成XIa，其随后增殖凝结级联， 最终引起凝血酶的产生和血纤蛋白的聚合来产生凝块。为了测量患者中所有止血相关的凝结因子的水平，必须进行两种凝结 测试。 一种是早先提及的PT测试，另一种是活化部分凝血活酶时间(aPTT) 测试。由于PT测试使用了组织因子来活化凝结级联，它对于外在途径中的 凝结因子是敏感的。aPT本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种凝血活酶试剂，包含： （ｉ）活化的ｓＴＦ， （ｉｉ）金属螯合脂质， （ｉｉｉ）金属离子，和 （ｉｖ）磷脂。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：詹姆斯亨利莫里西，埃米莉凯赖斯泰什沃特斯，
申请(专利权)人：伊利诺斯大学理事会，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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