本发明专利技术涉及一种荧蒽人工免疫原ＦＬ－ＢＳＡ及制备和用途，结构式如右，制备（１）将丁二酸酐、荧蒽、无水三氯化铝按摩尔比１∶１∶２．２投料，溶解于硝基苯中，冰浴搅拌，加稀盐酸终止反应，有机层用大量稀盐酸水洗后，旋转蒸发除去硝基苯，得黄色固体粉末，重结晶，干燥；（２）将溶有Ｎ－羟基琥珀酰亚胺和Ｎ，Ｎ′－二环己基碳酰亚胺逐滴加入溶有荧蒽半抗原中，搅拌反应，加入到磷酸盐缓冲溶液中，４℃反应２－６小时，透析后离心分出上清液，即得荧蒽人工免疫原ＦＬ－ＢＳＡ偶联物，经柱提纯，加入等量甘油－２０℃下冻干保存。本发明专利技术制备简便，成本低，容易工业化生产；荧蒽人工免疫原ＦＬ－ＢＳＡ通过免疫动物制备成荧蒽特异性抗体，用于现场检测水体、土壤及大气中痕量的荧蒽。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属荧蒽的多克隆抗体领域，特别是涉及一种一种荧蒽人工免疫原FL-BSA 及制备和用途。
技术介绍
多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)指两个以上苯环连在一起 的化合物，如萘、蒽、菲、荧蒽、苯并芘等。近年来，海上石油开采，轮船运输、海损 溢油，工业、生活燃烧废气排放等使得多环芳烃等有机污染日益严重，大量调査研究表 明，空气、土壤、水体及生物体等都受到了多环芳烃的污染。多环芳烃是最早发现且数 量最多的致癌物，目前已经发现的致癌性多环芳烃及其衍生物已超过400种，每年排放 到大气中的多环芳烃约几十万吨，因其毒性、生物蓄积性和半挥发性以及在环境中的持 久存在，已经受到国际科学界的广泛关注。1976年美国环保局提出129种"优先控制 污染物"中，多环芳烃类化合物就有16种；欧盟最新有害物质禁令中也列入了 16种多 环芳烃；1990年我国提出的水中优先控制的68种污染物中，多环芳烃类化合物就占7 种，在这些多环芳烃中检出率最高的是苯并荧蒽、荧蒽和苯并荧蒽，检出率分别 为59%, 48%和46%。荧蒽是多环芳烃中较常见的物质，存在于煤焦油的蒽油馏份中，经分馏精制而得， 可用做非磁性金属表面探伤荧光剂，也可用于制造合成染料和药物等。纯品荧蒽为白色 或黄绿色针状或片状结晶，能溶于乙醇、二硫化碳及苯等有机溶剂中。目前对荧蒽的检 测主要釆用高效液相色谱和气相色谱等分析方法，这些方法虽然准确可靠，可是由于对 样品的预处理复杂、耗时且需要大量有机溶剂萃取，并且在之后的检测过程中要用到精 密昂贵的检测仪器而不适于推广使用，也不利于当环境污染事故发生在野外时的现场快 速检测。因而寻求一种快速、简便、灵敏且经济实用的分析方法成为当前研究的主要方 向。20世纪60年代发展起来的免疫分析(Immmunoassay ， IA)是基于抗原与抗体的 特异性、可逆性结合反应的分析技术。免疫反应涉及抗原与抗体分子间的立体化学、电 荷、氢键和偶极间的综合应用，具有常规理化分析技术无可比拟的选择性和高灵敏度， 非常适宜于复杂基质中痕量组分的分析。因此，免疫分析具有特异性强、灵敏度高、方 便快捷、分析容量大、检测成本低、安全可靠等优点，可以满足简单、快速、灵敏地检 测环境激素的要求。1985年美国Cetus公司的K. B. Mullis和R. K. Saiki等专利技术了一种特异性DNA体外扩增技术，这个方法实质是体外酶促合成特异性DNA片断，又称无细胞 分子克隆系统，将这一技术称为Polymerase Chain Reaction简称PCR，即聚合酶链式 反应。1992年Sano等将免疫分析技术与PCR技术相结合，新研究出来的免疫PCR技术 由于兼具了免疫分析技术特异性强和PCR技术灵敏度高的优点，因而将会在环境微量痕 量污染物的检测中会有很好的应用前景。目前尚未见有用免疫分析方法检测荧蒽的报道，更没有见用免疫PCR技术检测荧蒽 的相关报道。而合格的荧蒽抗原是免疫得到合格荧蒽抗体的前提，合格的荧蒽抗体是建 立荧蒽免疫检测方法的关键，有关荧蒽抗原抗体的制备，国内外还未见报道。
技术实现思路
要解决的技术问题本专利技术要解决的技术问题是提供一种荧蒽人工免疫原FL-BSA及制备和用途，以克服 现有检测技术中对荧蒽样品预处理复杂、耗时、且需要大量有机溶剂萃取，以及在检测 过程中要用到精密昂贵的检测仪器而不适于推广使用和不利于当环境污染事故发生在 野外时的现场快速检测等缺点。 技术方案本专利技术的一种荧蒽人工免疫原FL-BSA,结构式如下 <formula>formula see original document page 5</formula>其中BSA是牛血清蛋白本专利技术采用活化酯法合成荧蒽人工免疫原，其反应方程式如下:<formula>formula see original document page 5</formula>本专利技术的一种荧蒽人工免疫原FL-BSA的制备方法，包括以下步骤 (1)荧蒽半抗原的合成将丁二酸酐、荧蒽、无水三氯化铝三者按摩尔比1:1:2.2 投料，并溶解于硝基苯中，得到无色溶液，冰浴下搅拌反应，整个反应在0-4'C冰浴下 进行7-8小时后，加入稀盐酸终止反应；将烧瓶中的液体倒出，加稀盐酸水解，分离出 的有机层用大量稀盐酸水洗后，旋转蒸发除去硝基苯，得到黄色固体粉末；在甲醇-乙 醚中重结晶获得黄色晶体状的荧蒽半抗原，干燥后得纯品。(2)荧蒽人工免疫原的合成将溶有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N，N' -二环已基 碳酰亚胺(DCC)的有机溶剂逐滴加入溶有荧蒽半抗原的有机溶剂中，室温下搅拌反应 6-12小时，4'C过夜，离心分出上清液；将上清液加入到溶有蛋白质的磷酸盐(PBS) 缓冲溶液中，4'C反应2-6小时，其中所述的半抗原、NHS、 DCC、蛋白质四者摩尔比分 别为1:1-4:1-4:0. 005-0. 05;反应完毕，将溶液装入透析袋，用蒸馏水透析或p服.8-7. 4 的PBS缓冲溶液或0.9X的生理盐水透析5d;透析后离心分出上清液，即得荧蒽人工免 疫原FL-BSA偶联物，经过柱提纯后，加入等量甘油-2(TC下冻干保存。所述步骤(1)中的荧蒽的分子结构式为 。 所述步骤(1)中的荧蒽半抗原的化学名称为荧蒽丁酸-Y-氧，分子量为302，分 子结构式如下所述步骤(2)中的有机溶剂是N， N-二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)。 本专利技术的一种荧蒽人工免疫原FL-BSA的用途，通过免疫动物制备成荧蒽特异性抗体，能与荧蒽发生特异性免疫反应的免疫球蛋白IgG，用于检测水体、土壤及大气中痕量的荧蒽，便于进行现场监测。由于荧蒽是小分子物质，只具有免疫反应性而不具有免疫原性，而且该分子上没有 能与蛋白质分子直接结合的氨基，羟基，羧基等基团，故本专利技术先通过Friede1-Crafts 酰基化反应使荧蒽分子带上一个四个碳链长的羧基，然后用活化酯法和混合酸酐法将这 个含羧基的半抗原分子与蛋白质分子偶联制备出荧蒽人工免疫原，再利用此免疫原对新 西兰大白兔进行免疫，获得对应的高效价、高特异性的的荧蒽多克隆抗体，此抗体将应 用于建立免疫PCR分析方法以检测环境中荧蒽。 有益效果本专利技术所制备的荧蒽特异性抗体具有如下优点-(1) 实用性强荧蒽的多克隆抗体制备技术具有重要的使用价值和实际意义，制备 的抗体特异性好、效价高，以抗原抗体免疫学反应为基础可用于样品测定；此抗体及其 制备方法为免疫PCR法测定环境中痕量的荧蒽提供保障，也为多环芳经荧蒽快速检测试 剂盒的研制解决了 一大技术难点。(2) 稳定性好本专利技术制备的荧蒽抗体具有较好的稳定性。(3) 抗体制备技术简便可行抗体整个制备过程无需特殊仪器设备，成本低廉，容易工业化规模生产。 附图说明图1是荧蒽人工免疫原FL-BSA的紫外光谱图其中BSA为牛血清蛋白，FL为荧蒽半抗原，FL-BSA为荧蒽人工免疫原。 具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的阐述，应理解，这些实施例仅用于说明本 专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领 域技术人员可以对本专利技术作各本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种荧蒽人工免疫原ＦＬ－ＢＳＡ，结构式如下： ＊＊＊ 其中ＢＳＡ是牛血清蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：庄惠生，周纯，
申请(专利权)人：东华大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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