整体活体动物中神经系统的非侵入性体内荧光成像技术方案

本发明专利技术公开了一种涉及检测动物中目的荧光蛋白表达的方法，其中所述动物为转基因动物，在其基因组中具有编码所述荧光蛋白的核酸，所述编码所述荧光蛋白的核酸可操作地连接来自通常在所述动物神经系统中表达的蛋白的启动子核酸，所述方法包括非侵入性检测在所述动物中表达的所述蛋白的荧光的步骤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】整体活体动物中神经系统的非侵入性体内荧光成像专利
本专利技术涉及包括对转基因动物中表达的荧光蛋白进行非侵入性成像 的方法。专利技术背景帕金森病(PD)是位于阿耳茨海默痴呆症之后居于第二位的最常见的 神经变性病症。据估计，仅在美国就有超过一百万个体患有这种致残疾 病，并且每年出现超过50,000新病例(Fahn and Przedborski, 2000)。作为 一种以运动徐緩、静止性震颤、强直和步态障碍为特征的进行性、年龄 相关的神经变性疾病，PD还以黑质中多巴胺能神经元的大量进行性破坏 为特征。如同很多其它的神经退行性疾病，PD自身主要表现为偶发情况， 意味着不存在任何遗传连锁，但是在罕见病例中，PD也可以作为简单的 孟德尔性状出现，与多种基因的缺陷连锁。尽管临床上和病理学上偶发和家族性PD可以在几个重要方面不同， 4旦是它们共有相同的生化脑部异常，即脑多巴胺的显著减少(Dauer and Przedborski, 2003)。 PD患者显示低水平脑多巴胺的原因源于黑质紋状体 多巴胺能途径的退化，所述多巴胺能途径由多巴胺能神经元构成，其细 胞体位于黑质中，伸出的轴突和神经末梢可见于紋状体中(Vila and Przedborski, 2004)。PD的最佳表征模型已经通过使用神经毒素MPTP而开发出来(Bloem et al., 1990， Flint Beal， 2001)。对MPTP的发现发生在1982年，当时加利 福尼亚的一群吸毒者表现出严重帕金森综合征的急性发作。研究发现该 综合征是由于自身注射一种合成的海洛因类似物而引起，而这种海洛因 类似物在制造过程中被副产物MPTP污染。随后，MPTP给药显示在小 鼠和灵长类动物中模拟PD。 MPTP为高度亲脂的，其可容易地穿过血脑 屏障。随后，其被B型单胺氧化酶转化为其活性代谢物一l-曱基-4-苯基吡啶鑰(MPP+)，然后该活性代谢物被高亲和性多巴胺和去曱肾上腺素摄 取系统摄取，并由此在黑质紋状体多巴胺能细胞的线粒体内聚集。这可 导致对细胞功能的多种有害作用，引起神经细胞死亡(Tatton and Kish， 1997， Tanji et al., 1999)。在小鼠中，2'-CH3-MPTP是比常规MPTP更为有 效的神经毒素，显示严重的组织病理学变化，包括细胞质膨胀、间质水 肿、多巴胺能神经元减少以及反应性小神经胶质细胞增殖和神经胶质增 生(Abdel-Wahab， 2005)。尽管对PD的大部分研究集中于成体进行， 一些报告令人信服地证实 对新生小鼠的全身MPTP注射导致永久的脑损伤，在成年期也还有痕迹。 发育中的脑对MPTP损伤敏感的事实还值得进一步研究。除了 MPTP,也已报道了多种其它的化学品在成体小鼠脑的不同区域 引起神经损伤。这些化学品包括一系列结构和功能上不同的化合物，从 工业上有毒的化合物、农业杀虫剂到食品添加剂。同样，迄今为止进行 的大部分神经毒性研究基于成体模型。但是，值得注意的是，具有较不 完整血脑屏障的发育中的脑更易于受到已知神经毒素的损伤，更关键的 是，该施加的损伤不能由发育中的脑完全和正确地代偿。因此，对于测 试化合物在发育中的脑中的潜在神经毒性而言，其重要性无论如何强调 也不过分，尤其是在处理沉默神经毒性(即，早期暴露于神经毒剂，但是 直至成年期才有临床症状)的问题时。美国环保局的发育神经毒性测试指 南(Developmental Neurotoxicity Testing Guideline, DNTG)进一步强调了 这点。最近，欧委会采纳了用新的欧盟管理框架来通过严格制度测试所 有的化学品的建议，据估计新措施耗资高至70亿欧元并需要至少10年 来实施。O'Callaghan(O'Callaghan， 1988)已提出，在中枢神经系统(CNS )的 星形细胞中优势表达的中间纤维蛋白 一胶质纤维酸性蛋白(GFAP),为监 测成体啮齿类动物脑中由各种神经毒剂(包括l-曱基-4-苯基-l,2,3,6-四氢 吡啶(MPTP))引起的神经损伤的早期和灵敏的生物标记(Reinhard et al., 1988， Araki et al.， 2001， Chen et al., 2002， Fields and tevens-Graham, 2002, Kurosaki et al., 2004)。 GFAP表达上调与神经学损伤增加相关。用于分析内源GFAP表达的常规方法主要包括免疫细胞化学、Northern印迹、 Western印迹和ELISA (O'Callaghan, 1991， Eng et al.， 2000)。GFAP基础启动子包括TATA和CAAT盒。增强子和沉默子序列可 见于-250和-80 bp之间以及-1980和-1500 bp之间。这些正调节区含有很 多转录因子的共有序列，包括cAMP应答元件和Sp-l、 NF-1、 AP-1以及 AP-2转录因子的结合位点。组织特异性由位于-1980至-1500bp区域的人 GFAP共有序列所赋予。反应性神经胶质增生(星形胶质增生)在应答对中枢神经系统(CNS)的 几乎任何物理或化学损伤中产生，以星形细胞体及其细胞突的肥大为特 征，伴随有GFAP表达的增加。反应性神经胶质增生伴随有GFAP的上 调。在外周神经系统创伤和毒性损伤后发生类似的GFAP增加。随着小鼠转基因学的进展和新的报告基因的获得，包括/3-半乳糖苷 酶(lacZ)、绿色荧光蛋白(GFP)和荧光酶(LUC)在内的几种报告基因被引入 转基因小鼠中在GFAP启动子控制下，并被证实是体内研究神经M增 生过程中GFAP转录活性的有用替代手段(Brenner et al., 1994， Zhuo et al.， 1997, Zhuetal., 2004)。WO 00/02997和US 6,501,003描述了在神经胶质细胞中表达绿色焚 光蛋白的转基因小鼠的产生。作者描述了在全包埋组织或者其切片中体 外检测视神经、脑、视网膜、坐骨神经和角膜中的焚光。
技术实现思路
出于有助于研究PD的发育方面和神经毒性的目的，本专利技术人建立了 非侵入性系统，其包括GFAP-GFP转基因小鼠模型和可购得的成像系统， 其使得能够在活体动物中研究神经学疾病、损伤和毒性的各个方面。该 系统还使以有效方式筛选大量化学品对发育中神经系统的神经毒性危险 成为可能。通过采用表达荧光蛋白的转基因动物(其中该荧光蛋白位于来自通常 在动物神经系统中表达的蛋白的启动子控制下)，本专利技术人已证实在整体 活体转基因动物中的荧光4企测可用于监测刺激物和测试物对来自该启动子的荧光蛋白表达的影响。这相对于现有技术有显著改进，其使得能在 体内实时或接近实时地监测测试物对完整动物神经系统的影响。最概括而言，本专利技术涉及在转基因动物中非侵入性检测来自荧光蛋 白的萸光的方法。根据本专利技术的第一方面，提供了一种涉及检测动物中目的荧光蛋白 表达的方法，其中所述动物为转基因动物，在其基因组中具有编码所述 荧光蛋白的核酸，所述编码所述荧光蛋白的核酸可操作地连接来自通常 在所述动物神经系统中表达的蛋白的启动子核酸，所述方法包括非侵入 性检测在所述动物中表达的所述蛋白的焚光的步骤。相应地，还提供本文档来自技高网...

【技术保护点】
涉及检测动物中目的荧光蛋白表达的方法，其中所述动物为转基因动物，在其基因组中具有编码所述荧光蛋白的核酸，所述编码所述荧光蛋白的核酸可操作地连接来自通常在所述动物神经系统中表达的蛋白的启动子核酸，所述方法包括非侵入性检测在所述动物中表达的所述蛋白的荧光的步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：卓朗，何炎坤，
申请(专利权)人：科技研究局，
类型：发明
国别省市：SG[新加坡]