基于CRISPR技术进行目标核酸检测的方法和系统技术方案

本发明专利技术提供了一种基于CRISPR技术进行目标核酸检测的方法和系统，具体地，涉及一种基于CRISPR技术检测目标核酸中是否存在待检测的特征序列的方法、系统和试剂盒，所述的检测方法包括向含有目标核酸的反应体系中加入核酸外切酶、gRNA、Cas蛋白和单链寡核苷酸。该方法可以有效缩短检测时间且具有更高的灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR技术进行目标核酸检测的方法和系统
本专利技术涉及核酸检测领域，尤其涉及基于CRISPR技术进行目标核酸检测的方法和系统。
技术介绍
特异性检测核酸分子(Nucleicaciddetection)方法具有重要的应用价值，例如病原体的检测，遗传病检测等。在病原体检测方面，由于每种病原体微生物都有其独一无二的特征核酸分子序列，因此可以开发出针对特定物种的核酸分子检测，也称为核酸诊断(NADs,nucleicaciddiagnostics)，在食品安全、环境微生物污染检测，人体病原菌感染等领域具有重要义。另一个方面是对人或其他物种的单核苷酸多态性(SNPs,singlenucleotidepolymorphisms)的检测。在基因组水平上去理解遗传变异和生物学功能之间的关系为现代分子生物学提供了新视角，而其中SNPs对生物学的功能、进化和疾病等密切相关，因此SNPs的检测与分析技术的发展尤为重要。目前建立的特异性核酸分子检测通常需要分为两步，第一步是目的核酸的扩增，第二步是目的核酸检测。现有检测技术包括限制性核酸内切酶方法、Southern、Northern、斑点杂交、荧光PCR检测技术、LAMP环介导等温扩增技术、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)等方法。2012年之后，CRISPR基因编辑技术兴起，张锋团队基于RPA技术开发了一种以Cas13为核心的靶向RNA的新核酸诊断技术(SHERLOCK技术)，Doudna团队开发了一种以Cas12酶为核心的诊断技术(DETECTR技术),中国科学院上海植物生理生态研究所王金博士等也开发了一种基于Cas12的新型核酸检测技术(HOLMES技术)。基于CRISPR技术开发的核酸检测技术正在日益发挥重要作用。尽管现有核酸检测技术众多，如何更加快速、简便、廉价、精确的检测仍然是改进检测技术的重要方向。因此，开发新型检测体系和检测方法在核酸检测领域仍具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术提供了一种基于CRISPR技术进行目标核酸检测的方法、系统和试剂盒。一方面，本专利技术提供了一种基于CRISPR技术检测目标核酸中是否存在待检测的特征序列的方法，所述方法包括：(1)提供目标核酸、核酸外切酶、gRNA、Cas蛋白和单链寡核苷酸；(2)所述核酸外切酶用于消化所述目标核酸以形成含有至少部分单链核酸的核酸序列；(3)所述gRNA能够靶向待检测的特征序列，所述Cas蛋白在所述gRNA的作用下识别所述待检测的特征序列，所述Cas蛋白识别所述待检测的特征序列后激发反式(trans)单链DNA切割活性；(4)所述Cas蛋白通过反式(trans)单链DNA切割活性切割所述单链寡核苷酸，所述单链寡核苷酸被Cas蛋白切割后与所述单链寡核苷酸被Cas蛋白切割前相比表现出可检测的区别；(5)测试是否能够检测出步骤(4)所述的可检测的区别；如果能够检测出步骤(4)所述的可检测的区别，则反映目标核酸中含有待检测的特征序列；或者，如果无法检测出步骤(4)所述的可检测的区别，则反映目标核酸中不含有待检测的特征序列。本专利技术中，所述核酸外切酶用于消化所述目标核酸以形成单链核酸，如图1所示，由于核酸外切酶的作用，会将双链的目标核酸切割成含有部分单链核酸的形式。在一个实施方式中，所述的目标核酸包括DNA、RNA，优选为双链核酸。在一个实施方式中，所述目标核酸来源于病毒、细菌、微生物、土壤、水源、人体、动物、植物等样品。优选的，所述目标核酸为PCR、NASBA、RPA、SDA、LAMP、HAD、NEAR、MDA、RCA、LCR、RAM扩增的产物。在一个实施方式中，所述方法还包括从样品中获得目标核酸的步骤。在一个实施方式中，所述待检测的特征序列为病毒特异的序列、细菌特异的序列、与疾病相关的特征序列、特定的突变位点或SNP位点；优选地，所述病毒为植物病毒或动物病毒；优选地，所述病毒为冠状病毒，优选地，SARS、SARS-CoV2(COVID-19)、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、Mers-Cov。如果目标核酸中存在上述待检测的特征序列，则可以反映出目标核酸来源的样品为某种病毒、细菌，或者是感染了某种病毒、细菌、疾病，或者是具有特定的突变位点或SNP位点。在一个实施方式中，所述Cas蛋白为具有双链和/或单链切割活性的蛋白。在一个实施方式中，所述Cas蛋白为具有Cis和trans切割活性的蛋白。在一个实施方式中，所述Cas蛋白选自V型CRISPR/CAS效应蛋白，包括：Cas12、Cas13、Cas14家族蛋白或其突变体。在一个实施方式中，所述Cas蛋白突变体包括氨基酸取代、缺失或替换，且所述突变体至少保留其trans切割活性。优选地，所述突变体具有Cis和trans切割活性。在一个实施方式中，所述Cas蛋白优选为Cas12家族，包括但不限于Cas12a、Cas12b、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12g、Cas12h；优选Cas12a、Cas12b。所述Cas12a，又称Cpf1，例如，中国专利申请CN107488710A中公开了Cas12a可以通过trans切割活性切割DNA探针从而用于核酸的检测，本专利技术在整个体系中加入核酸外切酶，结果显示其能够显著的提高Cas酶的检测灵敏度。进一步，所述Cas12a选自如下序列组成的蛋白：(1)SEQIDNo.1所示的蛋白；(2)将SEQIDNo.1所示氨基酸序或其活性片段列经过一个或多个(如2个、3个、4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有基本相同功能的衍生蛋白。在一个实施方式中，所述Cas12a蛋白还包括与上述序列具有50％，优选55％，优选60％，优选65％，优选70％，优选75％，优选80％，优选85％，优选90％，优选95％，序列同一性的，且具有trans活性的蛋白。所述Cas12b，又称C2c1，例如，中国专利申请CN109689875A公开了C2c1蛋白；中国专利申请CN110551800A中公开了Cas12b可以通过trans切割活性切割DNA探针从而用于核酸的检测，本专利技术在整个体系中加入核酸外切酶，结果显示其能够显著的提高Cas酶的检测灵敏度。本专利技术中，所述Cas12b优选如下序列组成的蛋白：(1)SEQIDNo.4所示的蛋白；(2)将SEQIDNo.4所示氨基酸序或其活性片段列经过一个或多个(如2个、3个、4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有基本相同功能的衍生蛋白。在一个实施方式中，所述Cas12b蛋白还包括与上述序列具有50％，优选55％，优选60％，优选65％，优选70％，优选75％，优选80％，优选85％，优选90％，优选95％，序列同一性的，且具有trans活性的蛋白。在一个实施方式中，所述gRN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于CRISPR技术检测目标核酸中是否存在待检测的特征序列的方法，其特征在于，所述方法包括：/n(1)提供目标核酸、核酸外切酶、gRNA、Cas蛋白和单链寡核苷酸；/n(2)所述核酸外切酶用于消化所述目标核酸以形成包含至少部分单链核酸的核酸序列；/n(3)所述gRNA能够靶向待检测的特征序列，所述Cas蛋白在所述gRNA的作用下识别所述待检测的特征序列，所述Cas蛋白识别所述待检测的特征序列后激发反式(trans)单链DNA切割活性；/n(4)所述Cas蛋白通过反式(trans)单链DNA切割活性切割所述单链寡核苷酸，所述单链寡核苷酸被Cas蛋白切割后与所述单链寡核苷酸被Cas蛋白切割前相比表现出可检测的区别；/n(5)测试是否能够检测出步骤(4)所述的可检测的区别；如果能够检测出步骤(4)所述的可检测的区别，则反映目标核酸中含有待检测的特征序列；或者，如果无法检测出步骤(4)所述的可检测的区别，则反映目标核酸中不含有待检测的特征序列；/n所述的Cas蛋白为具有trans切割活性的蛋白，优选，Cas12a和/或Cas12b。/n

【技术特征摘要】
20200430 CN 2020103682046;20200430 CN 2020103682121.一种基于CRISPR技术检测目标核酸中是否存在待检测的特征序列的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)提供目标核酸、核酸外切酶、gRNA、Cas蛋白和单链寡核苷酸；
(2)所述核酸外切酶用于消化所述目标核酸以形成包含至少部分单链核酸的核酸序列；
(3)所述gRNA能够靶向待检测的特征序列，所述Cas蛋白在所述gRNA的作用下识别所述待检测的特征序列，所述Cas蛋白识别所述待检测的特征序列后激发反式(trans)单链DNA切割活性；
(4)所述Cas蛋白通过反式(trans)单链DNA切割活性切割所述单链寡核苷酸，所述单链寡核苷酸被Cas蛋白切割后与所述单链寡核苷酸被Cas蛋白切割前相比表现出可检测的区别；
(5)测试是否能够检测出步骤(4)所述的可检测的区别；如果能够检测出步骤(4)所述的可检测的区别，则反映目标核酸中含有待检测的特征序列；或者，如果无法检测出步骤(4)所述的可检测的区别，则反映目标核酸中不含有待检测的特征序列；
所述的Cas蛋白为具有trans切割活性的蛋白，优选，Cas12a和/或Cas12b。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的核酸外切酸酶包括5’→3’核酸外切酶或3’→5’核酸外切酶；优选地，所述核酸外切酶为5’→3’外切核酸酶；更优选的，所述核酸外切酶选自T5核酸外切酶、T7核酸外切酶、λ核酸外切酶或exonucleaseVIII中的一种或任意几种。


3.如权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于，
所述单链寡核苷酸的5’端和3’端分别设置不同的报告基团，当所述单链寡核苷酸被切割后，可以表现出可检测的报告信号，通过报告信号的有无反映目标核酸中是否含有待检测的特征序列；
或者，所述单链寡核苷酸的5’端和3’端分别设置不同的标记分子，通过侧向流试纸，例如，胶体金试纸检测的方式，检测所述单链寡核苷酸被Cas蛋白切割前和被Cas蛋白切割后的结果以反映目标核酸中是否含有待检测的特征序列。


4.一种基于CRISPR技术检测目标核酸中是否存在待检测的特征序列的系统，所述系统包括：核酸外切酶、gRNA、Cas蛋白和单链寡核苷酸；
其中，所述核酸外切酶用于消化所述目标核酸以形成包含至少部分单链核酸的核酸序列；
所述gRNA能够靶向待检测的特征序列，所述Cas蛋白在所述gRNA的作用下识别所述待检测的特征序列，所述Cas蛋白识别所述待检测的特征序列后激发反式(trans)单链DNA切割活性；
所述Cas蛋白通过反式(trans)单链DNA切割活性切割所述单链寡核苷酸，所述单链寡核苷酸被Cas蛋白切割后与所述单链寡核苷酸被Cas蛋白切割前相比表现出可检测的区别；
如...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁亚峰，段志强，孙洁，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37