一种用于检测空肠弯曲菌的核酸免疫金标试纸条及试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测空肠弯曲菌的核酸免疫金标试纸条及试剂盒和方法。所述的试剂盒包括PCR反应体系，所述的PCR反应体系包括一引物对，所述的引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术使用用于试纸条检测空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)的试剂盒检测空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)特异性强、灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测空肠弯曲菌的核酸免疫金标试纸条及试剂盒和方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于试纸条检测空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)的试剂盒和方法。
技术介绍
食源性疾病的发病率居各类疾病总发病率的前列，成为最突出的公共卫生问题之一。目前统的微生物检验、病原分离、处理与控制已经不能满足当前食品监测工作的需要。因此建立简单、易用且灵敏度高的病原微生物检测新技术对于有效解决上述问题和技术难点具有重要意义。弯曲杆菌导致人类食源性腹泻疾病的主要病因之一，也是在世界各地引起肠胃炎的最常见细菌。在一些发达和发展中国家，该菌比食源性沙门氏菌所引起的腹泻病例还要多。它主要存在于诸如家禽、牛、猪、羊、鸵鸟和贝类等食用动物中，人类感染弯曲杆菌主要是由受污染的食品、水和环境引起。引起人类疾病的弯曲杆菌主要有空肠弯曲杆菌(C.jejuni)、结肠弯曲杆菌(C.coli)、胎儿弯曲杆菌(C.fetus)、海鸥弯曲杆菌(C.upsaliensis)和红嘴鸥弯曲杆菌(C.lari)。空肠弯曲杆菌最为常见，通常与人的格林-巴利等并发症有关。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是为克服现有技术中用于检测空肠弯曲杆菌的方法或者试剂盒成本高、操作繁琐、灵敏度低等问题，提供一种用于检测空肠弯曲菌的核酸免疫金标试纸条及试剂盒和方法。本专利技术人创造性地将PCR与免疫金标试纸条结合起来，并设计了特别适用于试纸条法的引物，大大降低了成本，简化了操作步骤，提高了检测空肠弯曲菌的灵敏度。本专利技术主要通过以下技术方案解决上述技术问题。本专利技术提供一种用于试纸条检测空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)的试剂盒，，其包括PCR反应体系，所述的PCR反应体系包括一引物对，所述的引物对中上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。较佳地，所述的上游引物经地高辛标记，且所述的下游引物经异硫氰酸盐标记。较佳地，所述试剂盒的扩增反应体系包括：0.25μL浓度为10μM的所述上游引物、0.25μL浓度为10μM的所述下游引物、12.5μL的PremixExTaq以及7μL的双蒸水。本专利技术中，所述试剂盒较佳地还包括试纸条，所述的试纸条包括吸水滤纸垫、结合物垫、附有FITC抗体与胶体金颗粒的交联体、侧向层析基质、检测带、质控带、衬底以及吸水垫；所述的检测带附有地高辛抗体；所述的质控带附有羊抗鼠二抗，所述的二抗包括抗FITC抗体和抗地高辛抗体。本专利技术中，所述的地高辛抗体的浓度较佳地为1mg/mL。本专利技术中，所述的FITC抗体的浓度较佳地为1mg/mL。本专利技术中，所述的抗地高辛抗体的浓度较佳地为1mg/mL。本专利技术中，所述的侧向层析基质较佳地为硝酸纤维素膜。本专利技术中，所述试剂盒较佳地还包括阳性对照和阴性对照；其中，所述的阳性对照优选空肠弯曲菌DNA；所述的阴性对照优选双蒸水。本专利技术还提供一种用于检测空肠弯曲菌的核酸免疫金标试纸条，所述的试纸条包括吸水滤纸垫、结合物垫、附有FITC抗体与胶体金颗粒的交联体、侧向层析基质、检测带、质控带、衬底以及吸水垫，其特征在于，所述的检测带附有地高辛抗体；所述的质控带附有羊抗鼠二抗，所述的二抗包括抗FITC抗体和抗地高辛抗体；较佳地：所述的地高辛抗体的浓度为1mg/mL；和/或，所述的FITC抗体的浓度为1mg/mL；和/或，所述的抗地高辛抗体的浓度为1mg/mL。本专利技术所述试纸条的结构见图13。其中图中各数字的含义如下：1：吸水滤纸垫；2：结合物垫，附有FITC抗体与胶体金颗粒的交联体3：侧向层析基质(硝酸纤维素膜)；4：检测带，附有地高辛抗体；5：质控带，附有羊抗鼠二抗；6：衬底；7：吸水垫。试纸条检测原理：利用裂解液破碎样本细胞，煮沸法或者磁珠法提取基因组DNA。以提取的DNA为模板，采用上游和下游引物分别经地高辛(Digoxigenin)和异硫氰酸盐(Fluorescein5-isothiocyanate，FITC)标记的空肠弯曲菌的特异性检测引物对特异性lpxA基因片段进行PCR扩增，阳性扩增产物的两端会分别带有地高辛和FITC。检测用试纸条上在吸水垫上含有金标记的FITC单克隆抗体，可与PCR产物一条链上的FITC标记分子结合，在T检测线位置上固定有抗地高辛抗体，可与PCR产物另一条链上的地高辛标记分子结合。在展开液的作用下，PCR扩增产物首先与金标记的FITC抗体结合，通过毛细作用带动胶体金向前端移动，在经过固定有地高辛抗体的检测线位置时，因带有地高辛标记而被地高辛抗体捕获在该位置上，显示棕红色，过量的金偶联物继续向上移动至固定有羊抗鼠二抗的C质控线位置，与二抗结合，从而显示出两条色带。如模板未扩增，则无PCR产物与地高辛抗体及FITC抗体结合，从而不能在检测线(T线)位置显示颜色。未参与反应的胶体金偶联物，向上一直扩散至质控线(C线)被羊抗鼠二抗捕获而显色。本专利技术还提供一种用于试纸条检测空肠弯曲菌的引物对，所述的引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供一种非诊断目的的检测空肠弯曲菌的方法，其包括如下步骤：(1)使用DNA提取试剂提取待检样品中的总DNA；(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板，利用如上所述试剂盒中的反应体系进行反应，得PCR产物；(3)将步骤(2)所得PCR产物点样于如上所述试剂盒中的试纸条上进行检测；并分析检测结果。较佳地，步骤(2)中所述反应的条件为：a.95℃预变性5min；b.95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min；c.将b.进行35个循环后进入72℃，7min；d.4℃保存。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本专利技术各较佳实例。本专利技术所用试剂和原料均市售可得。本专利技术的积极进步效果在于：本方法利用PCR与通用核酸检测免疫金标层析试纸条相结合的方法，通过比对空肠弯曲菌及其亲缘关系较近的结肠弯曲菌、胎儿弯曲杆菌、海鸥弯曲杆菌、红嘴鸥弯曲杆菌等其他弯曲菌的lpxA基因(编码UDP-N-乙酰葡萄糖胺酰基转移酶)序列差异，针对空肠弯曲菌特异的片段，设计上下游引物，并标记核酸扩增引物，优化反应体系，以通用核酸检测免疫金标层析试纸条为载体，通过PCR扩增产物与免疫金标层析试纸条的特异性结合，对其显色结果进行判读，实现对空肠弯曲菌的灵敏检测，最低检测限可达到3.1×103CFU/mL；且使用本专利技术的试剂盒和检测方法简便、快速、无毒、成本低。附图说明图1为空肠弯曲菌PCR-电泳特异性检测结果；M：DL2000marker；1：空肠弯曲菌NCTC11322；2：空肠弯曲菌NCTC11168；3：空肠弯曲菌NCTC13367；4：空肠弯曲菌ATCC49943；5：空肠弯曲菌ATCC4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于试纸条检测空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)的试剂盒，其特征在于，其包括PCR反应体系，所述的PCR反应体系包括一引物对，所述的引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于试纸条检测空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)的试剂盒，其特征在于，其包括PCR反应体系，所述的PCR反应体系包括一引物对，所述的引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


2.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的上游引物经地高辛标记，且所述的下游引物经异硫氰酸盐标记。


3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增反应体系包括：0.25μL浓度为10μM的所述上游引物、0.25μL浓度为10μM的所述下游引物、12.5μL的PremixExTaq以及7μL的双蒸水。


4.如权利要求1～3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括试纸条，所述的试纸条包括吸水滤纸垫、结合物垫、附有FITC抗体与胶体金颗粒的交联体、侧向层析基质、检测带、质控带、衬底以及吸水垫；所述的检测带附有地高辛抗体；所述的质控带附有羊抗鼠二抗，所述的二抗包括抗FITC抗体和抗地高辛抗体。


5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的地高辛抗体的浓度为1mg/mL；
所述的FITC抗体的浓度为1mg/mL；
和/或，所述的抗地高辛抗体的浓度为1mg/mL。


6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的侧向层析基质硝酸纤维素膜。


7.如权利要求1～6任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包...

【专利技术属性】
技术研发人员：申进玲，蒋原，赵丽娜，薛峰，苏静，郭德华，何宇平，
申请(专利权)人：上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：上海;31