一种柞蚕蛹虫草生物活性肽的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种柞蚕蛹虫草生物活性肽的制备方法，该方法首次采用最为接近天然冬虫夏草的柞蚕蛹虫草为原料，以保证制得小分子生物活性肽的丰富度、含量和抗氧化活性；同时配合采用双蛋白酶联合酶解法，使酶解更彻底，小分子肽比例提高，活性更强；而且双蛋白酶联合酶解法中采用的是食品级碱性蛋白酶和胰蛋白酶，大大降低了活性肽的制备成本；整个活性肽的制备全程是在55℃以下，没有高温环节，因此，制得的活性肽抗氧化能力和清除超氧自由基的能力强，具有易溶解、耐酸、耐热、稳定性高的优点；此外，制备获得的活性肽经高效液相色谱法分离后，图谱清晰、物质分离度高、分散度好，达到优质水平。

【技术实现步骤摘要】
一种柞蚕蛹虫草生物活性肽的制备方法
本专利技术公开涉及活性肽制备的
，尤其涉及一种柞蚕蛹虫草生物活性肽的制备方法。
技术介绍
蛹虫草，又名北冬虫夏草、北虫草，与冬虫夏草同属异种。研究表明蛹虫草具有与冬虫夏草极其相似的有效成分和药用功效，如益精气、补虚损、抑菌、降压、镇静、降糖、免疫调节等作用。同昂贵的野生冬虫夏草相比，人工栽培的蛹虫草成分体系豪不损失，特别在抗癌成分虫草素、喷司他丁含量上更显优势，此外，人工栽培的蛹虫草还含有虫草多糖、麦角甾醇、黄酮类、生物碱类、SOD酶等生物活性物质，这为蛹虫草高端产品开发奠定了物质基础。生物活性肽是机体完成各种生理活动必不可少的重要物质，在生物的代谢活动和疾病治疗中起着不可替代的作用。目前，生物活性肽大多是由冬虫夏草制备而成，随着人工栽培蛹虫草技术的提升，是否可将人工栽培蛹虫草作为原料进行生物活性肽的制备，成为人们研究的对象。
技术实现思路
鉴于此，本专利技术公开提供了一种柞蚕蛹虫草生物活性肽的制备方法，以实现以人工栽培的蛹虫草作为原料，制备获得高活性的生物活性肽。本专利技术提供的技术方案，具体为，一种柞蚕蛹虫草生物活性肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)以活体柞蚕蛹作为培养基，接种功能性蛹虫草“素高1号”液体菌种，经常规培养得子座完整的柞蚕蛹虫草；2)将步骤1)中的柞蚕蛹虫草子座进行冷冻干燥后，粉碎，得干粉；3)取步骤2)中的干粉，加去离子水后，加入碱性蛋白酶和胰蛋白酶两种蛋白酶进行酶解，得酶解液；4)将步骤3)中的酶解液经粗过滤以及离心去除固态渣子，留上清液；5)取步骤4)中的上清液依次注入分子量10万道尔顿的超滤柱、分子量1万道尔顿的超滤柱以及分子量1000道尔顿的超滤柱过滤，得小分子生物活性肽类混合液；6)在无菌条件下，将步骤5)中的小分子生物活性肽类混合液，采用细菌过滤器进行除菌，得成品。优选，在步骤6)之后将所述成品放入真空冷冻干燥机中，制备成肽类冷冻干燥粉。进一步优选，步骤1)中以活体柞蚕蛹作为培养基，接种功能性蛹虫草“素高1号”液体菌种后，在温度为15℃～20℃、湿度为70％～90％条件下，培养55天～60天，培养得子座完整的柞蚕蛹虫草。进一步优选，步骤2)中所述冷冻干燥的环境为：温度为-25℃，真空度为10-12Pa,高压均质压力为1.2×105KPa。进一步优选，步骤2)中粉碎得干粉的温度为-10℃至-20℃，干粉的细度为120目。进一步优选，按重量计，步骤3)中蛋白酶的加入量为干粉的6％，其中，碱性蛋白酶和胰蛋白酶的加入量为1:1，且先加入碱性蛋白酶后，再加入胰蛋白酶。进一步优选，碱性蛋白酶和胰蛋白酶的酶解温度均为55℃，按规定顺序酶解时间均为2h，底物浓度为10％。进一步优选，所述碱性蛋白酶为食品级20万U，所述胰蛋白酶为食品级10万U。进一步优选，步骤6)中采用的细菌过滤器为0.22微米的细菌过滤器。本专利技术提供的柞蚕蛹虫草生物活性肽的制备方法，该方法首次采用最为接近天然冬虫夏草的柞蚕蛹虫草为原料，以保证制得小分子生物活性肽的丰富度、含量和抗氧化活性；同时配合采用双蛋白酶联合酶解法，使酶解更彻底，小分子肽比例提高，活性更强；而且双蛋白酶联合酶解法中采用的为碱性蛋白酶和胰蛋白酶，大大降低了活性肽的制备方法；整个活性肽的制备全程是在55℃以下，没有高温环节，因此，制得的活性肽抗氧化能力和清除超氧自由基的能力强，具有易溶解、耐酸、耐热、稳定性高的优点；此外，制备获得的活性肽经高效液相色谱法分离后，图谱清晰、物质分离度高、分散度好，达到优质水平。本专利技术提供的柞蚕蛹虫草生物活性肽的制备方法，具有制备方法简单、易于操作等优点，制得的生物活性肽中小分子肽比例高，活性强等优点。应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本专利技术的公开。附图说明此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本专利技术的实施例，并与说明书一起用于解释本专利技术的原理。为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为实施例1中制作的蛋白质标准曲线；图2为实施例2中胰蛋白酶酶解时随时间因素的变化曲线；图3为实施例2中胰蛋白酶酶解时随加酶量因素的变化曲线；图4为实施例2中胰蛋白酶酶解时随底物浓度因素的变化曲线；图5为实施例2中碱性蛋白酶酶解时随时间因素的变化曲线；图6为实施例2中碱性蛋白酶酶解时随加酶量因素的变化曲线；图7为实施例2中碱性蛋白酶酶解时随底物浓度因素的变化曲线。具体实施方式下面以具体的实施方案对本专利技术进行进一步的解释说明，但是并不用于限制本专利技术的保护范围。实施例1：1、蛋白质标准曲线的制作(1)准确称量100mg牛血清白蛋白(BSA)，定容，配制10mg/mL的蛋白质标准溶液。(2)准确称量1.5g五水硫酸铜和6g酒石酸钾钠，加入500mL去离子水，搅拌后加入300mL10％的氢氧化钠溶液，最后用去离子水定容至1000mL，即双缩脲试剂(可长期保存)。(3)按下表将不同毫升的蒸馏水和牛血清白蛋白溶液加入各个试管中，加入4mL双缩脲试剂混匀后，室温下放置30min。以1mL去离子水为空白对照，在波长540nm处测定吸光值。重复3次，取平均值，以蛋白质浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，具体见图1。NO.123456BSA00.20.40.60.81.0蒸馏水1.00.80.60.40.20双缩脲试剂4.04.04.04.04.04.02、待测样品中多肽含量的测定取1mL待测样品，加入4mL双缩脲试剂混匀，室温下放置30min。在波长540nm处测定吸光值，代入标准曲线中计算待测样品浓度(mg/mL)。3、待测样品酶解度的测定采用TCA-SN％法，取4.5mL酶解液与4.5mL10％TCA溶液混合反应30min，4000r/min离心10min，取上清液1mL加入4mL双缩脲试剂，室温下放置30min，反应结束后，在540nm波长下测定吸光值，并根据下面的公式计算出蛹虫草酶解液的多肽指数。公式中：TCA-SN％蛹虫草酶解液的多肽指数；C蛋白质浓度(mg/mL)；V上清液体积(mL)；W蛹虫草的质量(mg)。实施例2：单酶酶解实验1、单酶筛选准确称量0.5g蛹虫草粉于试管本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种柞蚕蛹虫草生物活性肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：/n1)以活体柞蚕蛹作为培养基，接种功能性蛹虫草“素高1号”液体菌种，经常规培养得子座完整的柞蚕蛹虫草；/n2)将步骤1)中的柞蚕蛹虫草子座进行冷冻干燥后，粉碎，得干粉；/n3)取步骤2)中的干粉，加去离子水后，加入碱性蛋白酶和胰蛋白酶两种蛋白酶进行酶解，得酶解液；/n4)将步骤3)中的酶解液经粗过滤以及离心去除固态渣子，留上清液；/n5)取步骤4)中的上清液依次注入分子量10万道尔顿的超滤柱、分子量1万道尔顿的超滤柱以及分子量1000道尔顿的超滤柱过滤，得小分子生物活性肽类混合液；/n6)在无菌条件下，将步骤5)中的小分子生物活性肽类混合液，采用细菌过滤器进行除菌，得成品。/n

【技术特征摘要】
1.一种柞蚕蛹虫草生物活性肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)以活体柞蚕蛹作为培养基，接种功能性蛹虫草“素高1号”液体菌种，经常规培养得子座完整的柞蚕蛹虫草；
2)将步骤1)中的柞蚕蛹虫草子座进行冷冻干燥后，粉碎，得干粉；
3)取步骤2)中的干粉，加去离子水后，加入碱性蛋白酶和胰蛋白酶两种蛋白酶进行酶解，得酶解液；
4)将步骤3)中的酶解液经粗过滤以及离心去除固态渣子，留上清液；
5)取步骤4)中的上清液依次注入分子量10万道尔顿的超滤柱、分子量1万道尔顿的超滤柱以及分子量1000道尔顿的超滤柱过滤，得小分子生物活性肽类混合液；
6)在无菌条件下，将步骤5)中的小分子生物活性肽类混合液，采用细菌过滤器进行除菌，得成品。


2.根据权利要求1所述柞蚕蛹虫草生物活性肽的制备方法，其特征在于，在步骤6)之后将所述成品放入真空冷冻干燥机中，制备成肽类冷冻干燥粉。


3.根据权利要求1所述柞蚕蛹虫草生物活性肽的制备方法，其特征在于，步骤1)中以活体柞蚕蛹作为培养基，接种功能性蛹虫草“素高1号”液体菌种后，在温度为15℃～20℃、湿度为70％～90％条件下，培养55天～60天，培养得子座完整...

【专利技术属性】
技术研发人员：王美景，柳叶飞，王升厚，徐方旭，王泽，赵晓云，王萍萍，辛意贝，余柳柳，
申请(专利权)人：沈阳师范大学，沈阳虫林密宝北虫草食品科技有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁;21