一种鳗鱼免疫调节糖肽及其高效制备方法技术

本发明专利技术公开了一种鳗鱼免疫调节糖肽及其高效制备方法，属于水产加工技术领域，其主要利用鳗鱼加工下脚料——鳗鱼头为原料，经鳗鱼头蛋白液的制备、动态高压微射流预处理、酶解、脉冲电场强化超滤膜分离、糖基化修饰和冷冻干燥等步骤，制得一种具有免疫调节功能的糖肽。本发明专利技术制备得到的免疫调节糖肽的抗炎活性较好，且其可实现鳗鱼的深加工和副产物的综合利用，对于提高其附加值具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种鳗鱼免疫调节糖肽及其高效制备方法
本专利技术属于水产加工
，具体涉及一种鳗鱼免疫调节糖肽及其高效制备方法。
技术介绍
生物活性肽为由2-20个氨基酸组成的功能性肽段，常通过酶法或其他食品加工手段从源蛋白中释放出来，并且其往往具有比源蛋白更强的生物活性。另外，人体肠道内膜具有特殊的肽转运受体，能够在不破坏肽段构象的基础上将生物活性肽转运至人体循环系统。因此，生物活性肽具有比源蛋白更好的吸收活性。研究表明，局部慢性炎症与癌症、心血管疾病等有关，并且这类退化型疾病亦可加剧体内炎症，导致体内免疫稳态失调。然而，传统的抗炎药物如水飞蓟素、阿西莫林等，都伴随着长期潜在的副作用，过量使用容易引发肝功能损伤。免疫调节肽主要通过与细胞膜免疫受体相互作用或参与自由基反应来调节细胞、器官或组织的炎症过程。免疫调节肽通常是由5-10个氨基酸组成的寡肽，具有抑制一氧化氮氧合酶、m-TOR受体以及清除线粒体内膜中活性氧的功能；还可破坏致病细菌的细胞膜，达到抑菌的作用，改善局部炎症微环境。另外，免疫调节肽具有活性高、安全性好和制备成本低等特点。相关研究证明生物活性肽具有多靶向的特点，相关的免疫调节肽可从抗氧化、降血压以及抑制促炎因子等多种途径预防及抑制炎症，对由不同途径诱导的炎症反应均表现出一定的功效。因此，免疫调节肽不仅更符合消费趋势，且其综合抗炎效果优于传统的抗炎药物。然而，当今采用酶解法制备生物活性肽的效率较低，尤其是高度规则的寡聚体蛋白，如蛋白头部通过分子内氢键形成高度α-螺旋结构，在此基础上通过分子间作用力形成蛋白多聚体，蛋白酶无法与该区域内活性位点相互作用，不仅导致特定多肽片段无法被释放出来，并且使尾部大量呈β-转角和无规则结构的肽链被过度酶解。因此单纯的酶解法不利于高效制备生物活性肽。目前国内外普遍采用超声波、微波等物理手段对原蛋白质进行处理，使蛋白质分子结构展开，促进蛋白酶与酶切位点的相互作用，进而提高生物活性肽的得率。例如，专利（CN101849606A）公开了一种制备燕麦降血压肽的超声辅助酶解方法，通过250-1250W/100mL的超声场对燕麦蛋白预处理，5-10min后关闭超声并转入碱性蛋白酶酶解，以提高降血压肽的得率和活性。然而，对于疏水性较强的蛋白，超声波或微波等传统处理方式会引发蛋白重链间疏水聚集以及巯基的氧化，导致蛋白凝胶的产生，不利于后续的酶解。而动态高压微射流处理可使分子间氢键迅速解离，促进蛋白结构迅速展开，使α-螺旋转变为β-折叠和无规则结构，使高度α-螺旋头部的活性位点充分暴露，从而加速后续蛋白酶解效率，同时还可以提高免疫调节肽的活性。鳗鱼是一种高档水产品，营养丰富，素有“水中人参”的美誉，连续多年来在我国出口创汇单一水产品中排名第一，在我国水产养殖中占有重要地位。烤鳗是鳗鱼最主要的加工方式之一，是我国出口创汇水产品之一，其中以福建省出口量最大，占全国90%以上。随着烤鳗加工产业的蓬勃发展，鳗鱼加工过程产生的副产物问题越来越突出。鳗鱼头是烤鳗加工的主要副产物，含丰富的蛋白成分，有较高的利用价值。基于此，本专利技术采用真空沸腾法从鳗鱼头中提取高纯度蛋白，后经动态高压微射流法预处理、碱性蛋白酶酶解制备蛋白肽，并采用外加脉冲电场辅助超滤膜分离获得特定分子量的蛋白肽，后经高频超声辅助糖基化修饰制备高活性的免疫调节糖肽。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供了一种鳗鱼免疫调节糖肽及其高效制备方法，该方法简便快捷，所得免疫调节糖肽具有较高的功能活性。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种鳗鱼免疫调节糖肽，其制备方法包括鳗鱼头蛋白液的制备、动态高压微射流预处理、酶解、脉冲电场强化超滤膜分离、糖基化修饰和冷冻干燥的步骤；各步骤具体操作如下：（1）鳗鱼头蛋白液的制备：将鳗鱼头清洗后经滚筒烘干机烘干至水分含量小于10%，之后超微粉碎至过80目筛，再采用真空沸腾法从所得干粉中提取制备鳗鱼头蛋白液；（2）动态高压微射流预处理：在步骤（1）制备的鳗鱼头蛋白液中加入NaCO3，调整其pH值为9，之后采用高压微射流纳米均质机内进行处理；（3）酶解：利用碱性蛋白酶酶解步骤（2）预处理后的蛋白液，收集所得蛋白肽粗溶液；（4）脉冲电场强化超滤膜分离：将步骤（3）所得的蛋白肽粗溶液离心除去沉淀后进行脉冲电场强化超滤膜处理，选择截留分子量为5kDa和3kDa的超滤膜进行超滤，得到分子量为3000-5000Da的多肽溶液；（5）糖基化修饰：将步骤（4）所得多肽溶液置于高频超声场中，按肽：糖的质量比为1:3加入葡聚糖三糖，调节超声频率≥1.7MHz，超声功率为200-400W，超声温度为50-60℃，超声时间为20-40min，得到糖肽溶液；（6）冷冻干燥：将步骤（5）得到的糖肽溶液在-80℃预冻1h，然后移入冷冻干燥箱上层物料盘，在-80℃下继续冷冻干燥10h，得到所述免疫调节糖肽。步骤（1）所述真空沸腾法提取鳗鱼头蛋白液的具体操作为：将所得干粉置于提取反应釜内，加入干粉质量3倍的PBS缓冲液（50mmol、pH8.0），50℃恒温条件下常压搅拌浸泡45min，之后抽真空至12kPa左右，让整个提取溶液处于沸腾临界状态20min，之后恢复至常压，再搅拌提取10min，去除表面油脂后对提取液进行离心分离（5000r/min，15min），收集上清液即为鳗鱼头蛋白液。步骤（2）中高压微射流纳米均质处理的条件参数为：高压喷头孔径为5mm、处理压力为100-200MPa、处理温度为35℃、处理时间为10-30s、循环次数为5次。步骤（3）中所用碱性蛋白酶与蛋白液的重量比为1:8-1:15；酶解温度为40℃，酶解时间为60-120min，酶解pH=8-10。步骤（4）中脉冲电场的强度为650V/cm，频率为500Hz。本专利技术的显著优点为：（1）本专利技术采用真空沸腾法从鳗鱼加工副产物——鳗鱼头中提取蛋白，提高了鳗鱼头蛋白的纯度，显著改善了传统水提法因杂蛋白过多而导致多肽功能活性下降的问题。（2）本专利技术采用动态高压微射流辅助酶解技术，以破坏蛋白高度规则的六聚体结构，促进蛋白六聚体的解离，以及蛋白单体头部α-螺旋的快速展开，并提高了蛋白的溶解，使其潜在的酶解位点彻底暴露，增加了表面蛋白酶的活性位点，从而提高了酶解效率和多肽的功能活性。（3）本专利技术在鳗鱼头多肽超滤膜分离过程中，利用脉冲电场对其多肽分子链上的双键基团进行强化处理，以显著改善多肽的功能活性。（4）本专利技术通过高频超声辅助糖基化修饰处理，增加了蛋白的糖基化作用位点，使所得蛋白肽-葡聚糖三糖复合物具有良好功能活性。附图说明图1为鳗鱼免疫调节糖肽对由LPS诱导的HepG2炎症因子表达的影响；图2为鳗鱼免疫调节糖肽对由LPS诱导的HepG2抗氧化防御系统的影响。具体实施方式为了使本专利技术所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本专利技术所述的技术方案做进一步的说明，但是本专利技术不仅限于此。所用碱性蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鳗鱼免疫调节糖肽的高效制备方法，其特征在于：包括鳗鱼头蛋白液的制备、动态高压微射流预处理、酶解、脉冲电场强化超滤膜分离、糖基化修饰和冷冻干燥的步骤。/n

【技术特征摘要】
1.一种鳗鱼免疫调节糖肽的高效制备方法，其特征在于：包括鳗鱼头蛋白液的制备、动态高压微射流预处理、酶解、脉冲电场强化超滤膜分离、糖基化修饰和冷冻干燥的步骤。


2.根据权利要求1所述的鳗鱼免疫调节糖肽的高效制备方法，其特征在于：各步骤具体操作如下：
（1）鳗鱼头蛋白液的制备：将鳗鱼头清洗后烘干至水分含量小于10%，之后超微粉碎至过80目筛，再采用真空沸腾法从所得干粉中提取制备鳗鱼头蛋白液；
（2）动态高压微射流预处理：在步骤（1）制备的鳗鱼头蛋白液中加入NaCO3，调整其pH值为9，之后采用高压微射流纳米均质机内进行处理；
（3）酶解：利用碱性蛋白酶酶解步骤（2）预处理后的蛋白液，收集所得蛋白肽粗溶液；
（4）脉冲电场强化超滤膜分离：将步骤（3）所得的蛋白肽粗溶液离心除去沉淀后进行脉冲电场强化超滤膜处理，选择截留分子量为5kDa和3kDa的超滤膜进行超滤，得到分子量为3000-5000Da的多肽溶液；
（5）糖基化修饰：将步骤（4）所得多肽溶液置于高频超声场中，按肽：糖的质量比为1:3加入葡聚糖三糖，调节超声频率≥1.7MHz，超声功率为200-400W，超声温度为50-60℃，超声时间为20-40min，得到糖肽溶液；
（6）冷冻干燥：将步骤（5）得到的糖肽溶液在-80℃预冻1h，然后...

【专利技术属性】
技术研发人员：田玉庭，李致瑜，郑宝东，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建;35