一种高选择性次氯酸荧光探针的制备方法技术

本发明专利技术属荧光探针领域，具体涉及一种高选择性次氯酸荧光探针的制备方法和应用。本发明专利技术提供了7‑二甲氨基香豆素‑3‑羧酸与2，4‑二硝基苯肼通过两步反应得到荧光探针的制备方法；本发明专利技术制备的高选择性次氯酸荧光探针具有低背景荧光，并且对次氯酸的检测具有良好的灵敏度和高选择性；该探针可以在生理pH条件下实现对次氯酸的检测；该探针制成的试纸已经成功用于水中次氯酸的检测；该探针已经成功用于非治疗目的的活细胞中次氯酸的检测。

【技术实现步骤摘要】
一种高选择性次氯酸荧光探针的制备方法
本专利技术属于荧光探针
，具体涉及一种高选择性次氯酸荧光探针的制备方法及其水中次氯酸的试纸检测应用和非治疗目的的活细胞内次氯酸荧光成像检测应用。
技术介绍
次氯酸是一种重要的活性氧物质，具有强氧化性，在生产和生活中的用途十分广泛，常被用作漂白剂和消毒剂。生物体中的内源性次氯酸是由过氧化氢(H2O2)和氯离子(Cl-)在髓过氧化物酶(MPO)的催化条件下反应生成的。次氯酸由于具有极强的抗菌特性而在免疫系统中起到重要的作用，是生物防御过程中的一个重要环节。此外，次氯酸也影响着多种生理和病理过程，当人体内次氯酸的浓度发生异常时会产生氧化应激现象，损伤组织和蛋白质进而引发癌症、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化和肺部损伤等多种疾病。因此，设计高效的次氯酸检测方法具有十分重要的现实意义。传统的次氯酸检测方法有很多，例如碘滴定法、化学发光法、比色法和核磁共振法等。但是这些方法由于操作复杂、成本高以及对检测的环境有要求等缺点而限制了其应用。相比之下，荧光探针法通过使用前后荧光信号的改变来实现对目标物质的检测，具有灵敏度高、选择性强、响应迅速、操作简单和可视化成像等优点而成为检测次氯酸的有力工具。在各种荧光基团中，香豆素荧光基团由于具有高荧光量子产率、良好的光稳定性、在可见光区域的吸收和发射以及大斯托克斯位移等良好的光学性质而成为首选的理想荧光基团之一。目前已经报道了许多用于检测次氯酸的荧光探针，但是这些荧光探针具有不同的缺陷，例如合成步骤复杂、对次氯酸的选择性差、背景荧光过高、水溶性低和响应不够迅速等。其中，探针的背景荧光过高是导致检测的准确性降低的重要影响因素。因此，开发出高选择性且具有低背景荧光的次氯酸荧光探针十分必要和重要的。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题及目前需求，本专利技术人对此做了大量的文献调研和深入研究，提供了一种高选择性次氯酸荧光探针。本专利技术的技术方案是，一种高选择性次氯酸荧光探针，其分子结构如下：本专利技术还提供了一种高选择性次氯酸荧光探针的制备方法，步骤如下：(1)惰性气氛保护下，按比例将7-二甲氨基香豆素-3-羧酸与氯化亚砜搅拌反应生成7-二甲氨基香豆素-3-酰氯；(2)将步骤(1)中制备的7-二甲氨基香豆素-3-酰氯和2，4-二硝基苯肼按一定比例加入到无水二氯甲烷中，再加入无水三乙胺，使用磁力搅拌器在室温下搅拌；(3)停止反应，旋除溶剂；将粗产物用二氯甲烷为淋洗剂进行硅胶柱柱层析纯化，旋除溶剂并真空干燥，得到黄色固体，为探针分子化合物CMFP-HOCl；即为本专利技术所要制备的一种高选择性次氯酸荧光探针分子。步骤(1)中，所述7-二甲氨基香豆素-3-羧酸、氯化亚砜的用量关系为1.2g：5mL。步骤(1)中，所述搅拌反应的温度为室温，搅拌的时间为4h；所述惰性气氛为氮气。步骤(2)中，所述7-二甲氨基香豆素-3-酰氯、2，4-二硝基苯肼、无水三乙胺和无水二氯甲烷的用量关系为1.2mmol：0.75mmol：2mL：10mL。步骤(2)中，所述室温搅拌的时间为24h。步骤(3)中，所述真空干燥的时间为3h。将本专利技术制备的高选择性次氯酸荧光探针制成试纸，成功用于水中次氯酸的检测。将本专利技术制备的高选择性次氯酸荧光探针应用于非治疗目的的活细胞中次氯酸的荧光成像。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术所制备的高选择性次氯酸荧光探针CMFP-HOCl中含有能够自由旋转的N-N单键，可导致荧光基团的荧光淬灭；同时其含有的2，4-二硝基苯肼也是强荧光淬灭基团。在二者的协同作用下荧光探针CMFP-HOCl自身荧光极弱，有利于消除背景荧光干扰，得到更准确、更灵敏的检测效果。(2)本专利技术所制备高选择性次氯酸荧光探针CMFP-HOCl表现出对次氯酸良好的光谱响应性能。探针自身在473nm处具有极低的荧光发射强度；加入次氯酸后，在473nm有明显的荧光发射且随着次氯酸浓度的增加而逐渐增强。然后，探究了荧光探针CMFP-HOCl的选择性。考察了探针对常见阴离子(F-、Br-、Cl-、NO2-、SO32-)、阳离子(Mg2+)、活性氧(HOCl、H2O2、·OH、1O2)、活性氮(NO·)和与生物相关的氨基酸(Cys、Hcy、GSH)的荧光响应情况。实验结果表明，只有加入次氯酸时探针才有响应；当加入55μM次氯酸时，荧光强度增强了20倍；而加入其他物质时，探针的荧光强度没有明显改变，表明探针对次氯酸具有良好的选择性。此外，研究了pH对探针响应次氯酸过程的影响。结果表明，探针能够在生理pH条件下对次氯酸进行检测。(3)本专利技术所制备高选择性次氯酸荧光探针CMFP-HOCl可以在制成试纸后对不同浓度的次氯酸进行方便与迅速的检测，具有良好的实际应用潜能。(4)本专利技术所制备高选择性次氯酸荧光探针CMFP-HOCl能够用于非治疗目的的活细胞内次氯酸的荧光成像检测。附图说明图1为荧光探针CMFP-HOCl的合成路线。图2(a)为荧光探针CMFP-HOCl(10μM)响应不同浓度次氯酸(0～55μM)的荧光光谱；(b)为荧光探针CMFP-HOCl(10μM)响应不同浓度次氯酸(0～55μM)时，在473nm处的荧光强度与次氯酸浓度的拟合曲线。图3(a)为手持型365nm紫外灯照射下，荧光探针CMFP-HOCl(10μM)、荧光探针CMFP-HOCl(10μM)分别与55μM各反应物(2-15)作用后的荧光图；(b)为荧光探针CMFP-HOCl(10μM)、荧光探针CMFP-HOCl(10μM)分别与55μM的各反应物(2-15)作用后，探针在473nm处的荧光强度增强倍数(λex＝400nm)；其中反应物2-15分别代表Mg2+、Cys、Hcy、GSH、F-、Br-、Cl-、NO2-SO32-、HOCl、H2O2、·OH、1O2和NO·。图4为加入20μMHOCl前(■)后(●)，荧光探针CMFP-HOCl(10μM)的荧光强度随pH的变化图(λex＝400nm，λem＝473nm)。图5为使用荧光探针CMFP-HOCl制备的试纸条分别检测各浓度HOCl时，在日光灯下(上图)与365nm紫外灯下(下图)照射下的图像，其中(A)0μM；(B)10μM；(C)60μM；(D)120μM；(E)550μM；(F)1000μM。图6为荧光探针CMFP-HOCl在HeLa细胞中的成像图。a-c)细胞在37℃下与荧光探针CMFP-HOCl(10μM)孵育30min的图像；d-f)细胞先在37℃下与荧光探针CMFP-HOCl(10μM)孵育30min，再与HOCl(15μM)孵育30min后的图像。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受下述实施例的限制。实施例1：荧光探针的合成；合成路线如图1。7-二甲氨基香豆素-3-酰氯的合成：在100ml圆本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高选择性次氯酸荧光探针，其特征在于，结构如下：/n

【技术特征摘要】
1.一种高选择性次氯酸荧光探针，其特征在于，结构如下：





2.如权利要求1所述的一种高选择性次氯酸荧光探针的制备方法，其特征在于，反应步骤如下：
(1)惰性气氛保护下，按比例将7-二甲氨基香豆素-3-羧酸与氯化亚砜搅拌反应生成7-二甲氨基香豆素-3-酰氯；
(2)将步骤(1)中制备的7-二甲氨基香豆素-3-酰氯和2，4-二硝基苯肼按一定比例加入到无水二氯甲烷中，再加入无水三乙胺，使用磁力搅拌器在室温下搅拌；
(3)停止反应，旋除溶剂；将粗产物用二氯甲烷为淋洗剂进行硅胶柱柱层析纯化，旋除溶剂并真空干燥，得到黄色固体，为探针分子化合物CMFP-HOCl；即为次氯酸荧光探针分子。


3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述7-二甲氨基香豆素-3-羧酸、氯化亚砜的用量关系为1.2g：5mL。


4.如权利要求2所述的制...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜舒，韩志湘，许海，王洋，董良欢，代晓婷，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32