一种线粒体靶向的双光子激发近红外发射的硫化氢荧光探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术专利公开了一种可以直接用于线粒体靶向的双光子激发近红外发射的硫化氢荧光探针及其制备方法和应用，属于化学与生物分析检测领域。其分子结构式如式I所示

【技术实现步骤摘要】
一种线粒体靶向的双光子激发近红外发射的硫化氢荧光探针及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种线粒体靶向的双光子激发近红外发射的硫化氢荧光探针及其制备方法和应用，属于化学与生物分析检测成像

技术介绍
硫化氢(H2S)在生物体内由酶催化产生，作为人体内气体信号分子，在调节人的生理机能方面起着极其重要的作用。例如，调节血管张力、心肌收缩、神经传导和胰岛素分泌等；硫化氢还能够有效清除活性氧，活性氮物种，例如：过氧化氢、超氧阴离子、次氯酸、过氧亚硝基等；硫化氢可参与血红蛋白改变；参与体内亚硝基类化合物的还原；调节体内多种酶的功能。实验表明，硫化氢能够有效地降低AP诱导的神经细胞毒性。硫化氢与FPG表现为负比例关系，升高二型糖尿病病人硫化氢浓度也许有助于降血糖。但是，生物体内硫化氢失调，便会引起动脉和肺动脉高压、老年痴呆症、胃粘膜损伤和肝硬化等疾病。所以对生物体内硫化氢的检测意义极其重要。荧光探针具有操作简便、灵敏度高、膜透性好和快速原位检测等优点。因此荧光探针在生物医学成像分析具有很好的应用前景。而近红外荧光探针因其优越的光学性能而倍受科研工作者的青睐。但是传统的近红外荧光探针虽然其发射位于近红外区，但是其激发大部分仍然在可见光区，因此在成像时会受到组织吸收，自发荧光等的影响而使其穿透深度和分辨率受限。因此发展近红外激发近红外发射的荧光探针具有重要的作用。在过去双光子荧光探针是用两个光子的近红外光激发，但是发射在紫外-可见光区，因此导致穿透深度不够。把双光子与近红外荧光探针相结合，可以很好的解决发射与激发波长短而引起的组织穿透深度受限的问题。因此本专利技术专利将开发一种双光子激发近红外发射的硫化氢荧光探针。
技术实现思路
本项目针对上述技术现状和存在的问题，提供一种线粒体靶向双光子激发近红外发射的硫化氢荧光探针MNIR-H2S。该荧光探针具有合成简单，反应条件温和，成本较低，且具有大的双光子吸收截面、近红外发射、高灵敏度和高选择性，能实现用荧光法快速便捷的检测癌细胞和组织中的硫化氢。本专利技术还提供了该荧光探针的制备方法。本专利技术还提供了该荧光探针的应用。本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现：一种线粒体靶向的双光子激发近红外发射的硫化氢荧光探针，其化学结构式如式(I)所示：本专利技术还提供一种线粒体靶向的双光子激发近红外发射的硫化氢荧光探针的制备方法，包括以下步骤：S1.将2，4-二羟基水杨醛、乙酰乙酸甲酯加入反应器中，加入溶媒和催化剂，在60～80℃下反应，至2，4-二羟基水杨醛完全消失则终止反应，把反应体系冷却到室温后倒入冰水中，析出得到的黄色固体产物1，干燥所述产物1，所述产物1的结构式如下：S2.将步骤S1所得的产物1与酮酸加入反应瓶中，加入溶媒和催化剂，加热到80～110℃反应3～5小时，把反应体系冷却到室温后倒入冰水中，滴加适量的高氯酸，析出得到褐色固体，干燥后进行分离提纯，得化合物2，所述化合物2的结构式如下：S3.将上一步所得的产物2与2，4-二硝基氟苯，二氯甲烷和催化量的三乙胺加入反应瓶中，25～55℃反应3～5小时，将所得产物干燥后进行分离提纯，得到如式(I)所示的目标探针。本专利技术荧光探针的合成路线如图1所示。本专利技术的荧光探针使用方法为：探针分子溶解在pH＝7.4的PBS缓冲溶剂中，在室温下进行测试。当加入NaHS时，2，4-二硝基苯醚基团可以在H2S的诱导下裂解，使荧光得以恢复，探针与H2S的响应机理如图2所示。本专利技术的荧光探针的具体特征为：探针自身不具有荧光发射信号，当其与H2S作用后，探针分子在668nm处有显著的荧光信号发射峰，荧光强度增强了150倍；因其具有氧正离子，因此，此特征将赋予其具有线粒体靶向的能力，而且经过测定，其具有很好的双光子吸收截面，因此具有双光子激发。优选地，步骤S1中，步骤S1中：2，4-二羟基水杨醛与乙酰乙酸甲酯的摩尔比为1：1～5。优选地，步骤S1中：所述催化剂为哌啶，所述溶媒为乙醇，进一步优选所述哌啶为1％～10％的2，4-二羟基水杨醛的质量比重，1摩尔2，4-二羟基水杨醛用2000～5000mL乙醇。优选地，步骤S1反应过程中，用薄层色谱法跟踪反应，直到2，4-二羟基水杨醛完全消失为止。优选地，步骤S2中，浓硫酸做为溶媒和催化剂。优选地，步骤S2中，所述酮酸为4-二乙氨基酮酸。优选地，步骤S2中：1摩尔酮酸用50～100mL浓硫酸。优选地，步骤S1或S2中，待大量固体产物析出后，减压抽滤并用冷水洗涤3次，再将得到的固体产物进行干燥。优选地，步骤S2或S3中，干燥后的产物采用柱层析提纯，进一步优选所述填充剂为200～300目的硅胶，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1。。本专利技术还提供了所述的线粒体靶向的双光子激发近红外发射的硫化氢荧光探针的应用，用于癌细胞和组织中硫化氢的荧光检测和成像分析。相对现有技术，本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术所述探针分子的合成只需要三步就可以完成，且后处理过程相对简单，合成成本低，对H2S具有高灵敏度，高选择性，且能实现用荧光法快速便捷的实现癌细胞和组织中的H2S的检测与成像。(2)本专利技术所述探针分子自身不具有荧光发射信号，当其与H2S作用后，探针分子在668nm处有显著的荧光信号发射峰，荧光强度增强了60倍；因其具有氧正离子，因此，此特征将赋予其具有线粒体靶向的能力，而且经过测定，其具有很好的双光子吸收截面，因此具有双光子激发。其性能将在实施例中结合附图给予详细说明。附图说明附图1为本专利技术双光子激发近红外发射H2S荧光探针的合成路线图。附图2为本专利技术双光子激发近红外发射H2S荧光探针与H2S的响应机理示意图。附图3：(a)为MNIR-H2S(表示式Ⅰ所述双光子激发近红外发射H2S荧光探针，下同)和MNIR-H2S+H2S归一化的紫外-可见吸收谱图；(b)探针分子(1μM)对H2S的响应的荧光谱图，硫化氢(0-40μM)；(c)为校准曲线；(d)为线性响应；(e)和(f)分别MNIR-H2S为加硫化氢前后在可见光下得到的图片。附图4：(a)为选择性实验,1微摩尔探针分子加入40微摩尔硫化氢或者90微摩尔其它分析物。数字1到16分别是空白(探针分子)，GSH,Cys,VitaminC,K+,Ca2+,Na+,Mg2+,Zn2+,Fe3+,Gly,Cu2+,Blank,H2S,Pb2+,andGlu；(b)为pH(3～8)对探针分子在加入H2S前后的影响。附图5为激光共聚焦荧光显微镜对HeLa细胞的成像研究：A(a)加探针培养，不加硫化氢刺激下的红色通道成像；A(b)明场和红色通道的叠加成像；A(c)加探针和硫化氢刺激下的红色通道成像图；A(d)为明场与红色通道的叠加成像；B共定位成像：(a)红色通道成像，探针加硫化氢刺激和商业化定位试剂，(b)绿色通道成像，(c)红色通道和绿色通道的叠加成像，(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种线粒体靶向的双光子激发近红外发射的硫化氢荧光探针，其特征在于，其化学结构式如式(I)所示：/n

【技术特征摘要】
1.一种线粒体靶向的双光子激发近红外发射的硫化氢荧光探针，其特征在于，其化学结构式如式(I)所示：





2.一种权利要求1所述的线粒体靶向的双光子激发近红外发射的硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将2，4-二羟基水杨醛、乙酰乙酸甲酯加入反应器中，加入溶媒和催化剂，在60～80℃下反应，至2，4-二羟基水杨醛完全消失则终止反应，把反应体系冷却到室温后倒入冰水中，析出得到的黄色固体产物1，干燥所述产物1，所述产物1的结构式如下：



S2.将步骤S1所得的产物1与酮酸加入反应瓶中，加入溶媒和催化剂，加热到80～110℃反应3-5小时，把反应体系冷却到室温后倒入冰水中，滴加适量的高氯酸，析出得到褐色固体，干燥后进行分离提纯，得化合物2，所述化合物2的结构式如下：



S3.将上一步所得的化合物2与2，4-二硝基氟苯，二氯甲烷和催化量的三乙胺加入反应瓶中，25～55℃反应3-5小时，将所得产物干燥后进行分离提纯，得到如式(I)所示的目标探针分子。


3.根据权利要求2所述的一种线粒体靶向的双光子激发近红外发射的硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤S1中：2，4-二羟基水杨醛与乙酰乙酸甲酯的摩尔比为1：1～5。


4.根据权利要求3所述的一种线粒体靶向的双光子激发近红外发射的硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤S1中：所述催化剂为哌...

【专利技术属性】
技术研发人员：周礼义，
申请(专利权)人：中南林业科技大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43