调节重组蛋白中甘露糖含量的方法技术

本发明专利技术涉及调节重组蛋白中甘露糖含量的方法，具体地调节(例如，降低)重组糖蛋白中的甘露糖含量，特别是高甘露糖含量的方法。

【技术实现步骤摘要】
调节重组蛋白中甘露糖含量的方法本申请是申请日为2007年01月23日的中国专利申请CN200780006761.6“调节重组蛋白中甘露糖含量的方法”的分案申请。
本专利技术涉及调节(例如，降低)重组糖蛋白中的甘露糖含量，特别是高甘露糖含量的方法。
技术介绍
高等真核生物进行各种翻译后修饰，包括甲基化，硫酸化，磷酸化，脂质添加和糖基化。这种修饰对蛋白的功能可能是极其重要的。分泌蛋白，膜蛋白，和被靶向囊泡或某些细胞内细胞器的蛋白，可能是被糖基化的。N-糖基化是一种糖基化形式，其包括添加寡糖到蛋白中的识别序列(例如，Asn-X-Ser/Thr)中发现的天冬酰胺残基上。N-连接的糖蛋白包含标准的分支结构，其由甘露糖(Man)，半乳糖，N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)和神经氨酸组成。蛋白N-糖基化一般发生于内质网(ER)，其中在多萜醇(一种脂质载体中间体)上组装的N-连接的寡糖(例如，GlC3Man9GlcNAc2)，转移到新生蛋白的合适的天冬酰胺(Asn)上。这是所有真核生物的N-连接的糖蛋白共有的事件。存在两种重要类型的N-连接糖：高甘露糖寡糖和复合寡糖。高甘露糖寡糖一般包括具有许多甘露糖残基(例如，大于4)的两个N-乙酰葡萄糖胺。复合寡糖如此命名，因为它们可以包含几乎任何数量的其它类型的糖，包括超过原始的两个N-乙酰葡萄糖胺。蛋白可以在蛋白的不同部分上被两类寡糖糖基化。寡糖是高甘露糖的还是复合的，据认为取决于在高尔基体中它对糖修饰蛋白的可及性，如果糖是相对难接近的，它将很可能保持它的原始高甘露糖形式。如果它是可接近的，那么可能许多甘露糖残基将裂解，而且糖将通过添加如上所述的其它类型基团而进一步被修饰。寡糖链已经添加到蛋白以后，通过3个不同的酶以固定顺序除去3个葡萄糖和1个甘露糖残基。该事件发生在ER中，而且是蛋白可以被转运到Golgi用于进一步加工的一个信号。在ER中加工以后，形成高甘露糖型寡糖。3个葡萄糖残基和1个特定的α-1，2-连接的甘露糖残基被ER内的特异性葡糖苷酶和α-1，2-甘露糖苷酶除去，导致核心寡糖结构，Man8GlcNAc2。具有这种核心糖结构的蛋白转运到高尔基体中，糖部分在本文中进行各种修饰。在哺乳动物细胞中，糖链修饰通过3种不同的途径进行，取决于其上添加的蛋白部分。3种不同的途径是：(1)核心糖链不改变；(2)通过添加UDP-N-乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)中的N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸盐部分(G1cNAc-1-P)到核心糖链中的甘露糖的6-位置，然后除去GlcNAc部分以形成糖蛋白中的酸性糖链，而使核心糖链改变；或(3)通过用甘露糖苷酶I除去3个甘露糖残基，核心糖链首先转变成Man5GlcNAc2；通过添加GlcNAc和除去另外的2个甘露糖残基，接着连续添加GlcNAc，半乳糖(Gal)，和N-乙酰神经氨酸(也称为唾液酸(NeuNAc))，以形成各种杂合的或复合的糖链(R.KornfeldandS.Kornfeld，Ann.Rev.Biochem.54：631-664(1985)；Chibaetal.，J.Biol.Chem.273：26298-26304(1998))。重组蛋白的寡糖含量能影响治疗糖蛋白的安全和功效。因此，用于控制这种糖蛋白的寡糖含量，尤其是甘露糖含量的方法将是有益的。糖蛋白组合物，尤其是治疗抗体的高甘露糖含量，在治疗应用期间能显著地影响这些蛋白的安全和功效。不受特定理论的束缚，证据表明，由于例如，巨噬细胞和树突细胞上的甘露糖受体，高甘露糖糖蛋白比它们的低甘露糖对应物更快地从循环中清除。另外，高甘露糖糖蛋白预期更具有免疫原性。因此，生产具有低甘露糖含量的治疗糖蛋白，如例如治疗抗体，是合乎需要的。本专利技术人通过提供调节(例如，控制或降低)重组生产的蛋白质和肽的甘露糖含量的方法，解决了本领域中的这种需要。
技术实现思路
本专利技术是基于，至少部分地基于，影响重组表达的糖蛋白的甘露糖含量，特别是高甘露糖含量的因子的发现。因此，在一个方面，本专利技术提供了通过操纵细胞培养条件，调节哺乳动物宿主细胞中生产的重组糖蛋白的甘露糖含量(即，寡糖侧链上)的方法，以便细胞生产的糖蛋白具有低甘露糖含量。如本文中使用的，术语“低甘露糖含量”指这样的糖蛋白组合物，其中组合物中小于大约10％，或小于大约8％，或小于大约5％(例如，大约4％或更少)的糖蛋白具有超过4个甘露糖残基(即，是M5或更大的种类)。如本文中使用的，术语“低甘露糖含量”也指这样的糖蛋白组合物，其中组合物中小于大约10％，小于大约9％，小于大约8％，小于大约7％，小于大约6％，小于大约5％，小于大约4％，小于大约3％，小于大约2％，小于大约1％，或前述这些范围之间的任何值，或甚至为零的糖蛋白具有超过4个甘露糖残基。在本专利技术的一个实施方案中，通过保持细胞培养环境在低渗透压度(例如，于大约600mOsm/Kg，或于大约500mOsm/Kg，或于大约400mOsm/Kg，例如，在大约380到250mOsm/Kg之间)，来获得低甘露糖含量。这针对具有低甘露糖含量，即糖蛋白的寡糖侧链上具有4个或更少的甘露糖残基的糖蛋白，富集了细胞培养物。因此，在一个特定的实施方案中，本专利技术提供了一种用于生产具有低甘露糖含量的重组糖蛋白的方法，包括培养哺乳动物宿主细胞(例如，在培养的扩大或生产阶段)，其在渗透压度为大约600mOsm/Kg或更少(例如，大约200到600mOsm/Kg之间，例如，大约250到550mOsm/Kg，大约250到500mOsm/Kg，大约250到450mOsm/Kg，大约250到400mOsm/Kg，大约250到380mOsm/Kg，或大约250到350mOsm/Kg)的培养基中表达糖蛋白。上述渗透压度范围可以通过操纵许多细胞培养参数来获得，包括但不限于，细胞培养培养基中一种或多种盐，维生素，糖，蛋白胨和氨基酸的浓度。因此，在一个特定的实施方案中，本专利技术提供了一种通过在包含浓度为大约70mM或更少(例如，大约10mM到大约50mM)的钾；和/或浓度为大约200mM或更少(例如，大约50mM到大约100mM)的钠，并保持大约600mOsm/Kg或更少的细胞培养渗透压度的培养基中，培养表达糖蛋白的宿主细胞，生产具有低甘露糖含量的重组糖蛋白的方法。仍然在另一个实施方案中，本专利技术提供了一种通过在基本上没有一种或多种选自丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸，并保持大约600mOsm/Kg或更少的细胞培养渗透压度的培养基中，培养表达糖蛋白的宿主细胞，来生产具有低甘露糖含量的重组糖蛋白的方法。而且，仍然在另一个实施方案中，培养基可以包括选自生物素，D-泛酸钙，氯化胆碱，叶酸，i-肌醇，烟酰胺，盐酸吡哆醛，盐酸吡哆醇，核黄素，盐酸硫胺和氰钴胺素的一种或多种维生素，以大约0.00005g/L到大约0.9g/L的浓度。在又一个实施方案中，培养基包括浓度为大约1mM到大约90mM的葡萄糖。在进一步的实施方案中，培养基包括选自酵母抽提物，酵母水解物，大豆蛋白胨，大豆水解物，小本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产包含重组抗体或其抗原结合片段的组合物的方法，其中所述组合物中小于10%的抗体或其抗原结合片段具有超过4个甘露糖残基/N-连接的寡糖，所述方法包括：/n在培养基中培养表达该重组抗体或其抗原结合片段的哺乳动物宿主细胞，所述培养基具有：/n(i) 250到450 mOsm/Kg的渗透压度；和/n(ii) 浓度为0 mM至70 mM的钾，或浓度为0 mM至200 mM的钠。/n

【技术特征摘要】
20060123 US 60/761477;20061222 US 11/6443451.一种生产包含重组抗体或其抗原结合片段的组合物的方法，其中所述组合物中小于10%的抗体或其抗原结合片段具有超过4个甘露糖残基/N-连接的寡糖，所述方法包括：
在培养基中培养表达该重组抗体或其抗原结合片段的哺乳动物宿主细胞，所述培养基具有：
(i)250到450mOsm/Kg的渗透压度；和
(ii)浓度为0mM至70mM的钾，或浓度为0mM至200mM的钠。


2.一种生产包含结合IL-15的重组人单克隆抗体或其抗原结合片段的组合物的方法，其中所述组合物中小于10%的抗体或其抗原结合片段具有超过4个甘露糖残基/N-连接的寡糖，所述方法包括：
在培养基中培养表达该抗体或其抗原结合片段的哺乳动物宿主细胞，所述培养基具有：
(i)250到450mOsm/Kg的渗透压度；和
(ii)浓度为0mM至70mM的钾，或浓度为0mM至200mM的钠；
其中该抗体或其抗原结合片段包括含有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的轻链可变区，和含有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的重链可变区。
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【专利技术属性】
技术研发人员：J吴，N勒，M德拉克鲁兹，G弗莱恩，
申请(专利权)人：安进公司，
类型：发明
国别省市：美国;US