模块化DNA组装系统技术方案

描述了一种用于合成生物学的模块化和层次化DNA组装平台。这种被称为MIDAS(模块化幂等DNA组装系统)的赋能技术可以使用标准化的组装设计在单一反应中准确地组装多个DNA片段。它可用于从序列验证的、可重复使用的部件的文库建造基因和在单一载体中组装多个基因。我们描述了MIDAS的设计和用途及其在用于生产雀稗灵的代谢途径的重建中的应用，所述雀稗灵是许多吲哚二萜的生物合成中的关键中间体，所述吲哚二萜是由几种丝状真菌物种产生的一类经济上重要的次生代谢物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】模块化DNA组装系统
本专利技术总的来说涉及一种被称为MIDAS(模块化幂等DNA组装系统)的用于合成生物学的模块化和层次化DNA组装平台，利用这种系统使用标准化组装设计在单一反应中精确组装多个DNA片段的方法，以及重建生物合成途径用于后续生产至少一种吲哚二萜的方法。
技术介绍
合成生物学的核心要求是将生物系统分解为基本的、可重复使用的部件或模块，并以标准化方式重新组织和重新组装这些部件，以产生新的遗传模块、相互作用的蛋白质、控制回路、代谢途径和高价值产品的能力。近年来，已出现了大量赋能技术可以在遗传水平上满足这些要求。大多数这些技术分为四大类，每类都提供了强大的特点和局限性：(i)利用位点特异性重组酶将DNA分子组装在一起的技术，(ii)基于含有交叠序列的DNA分子的体外组装的技术，(iii)利用细胞的基于重组的机制来组装带有同源序列的DNA分子的体内技术，以及(iv)基于限制性酶的技术。位点特异性重组系统，例如基于噬菌体λ(1)或P1(2,3)或其组合(4,5)的系统，可用于多基因组装体的高效、高通量构建。然而，由于存在重组位点序列瘢痕，基于位点特异性重组的技术不容易地实现模块化设计，用于从较简单部件进行基因的组合装配。使用DNA序列交叠实现体外组装的技术例如重叠延伸PCR(6)、Gibson组装(7)、融入(In-Fusion)(8,9)和其他不依赖于连接的克隆方法(10,11)，可以在单一反应中将多个片段高效组装在一起，并且由于它们在很大程度上是不依赖于序列的(即不依赖于特定序列例如限制性酶识别位点)，因此产生无痕(无缝)组装。然而，这些技术不容易实现模块化，因为每次在引入新的片段或改变组装顺序时都需要设计新的引物组。已为大肠杆菌(12)、芽孢杆菌属物种(13,14)和酵母(15-18)开发了利用细胞同源重组机制将带有重叠末端序列的多个DNA片段组装在一起的体内组装方法。体内组装技术具有构建大型生化途径和基因组规模组装体的能力，但与交叠序列指导的体外组装方法一样，它们在本质上是量身定制的，不容易将其用于从较简单的部件进行基因的模块化组装。使用常规的(IIP型)限制性酶将DNA片段(例如基因)串联排列在一个载体中的传统方法苦于下述问题，即随着DNA片段数目的增加，可用的限制性酶变得有限，并且克隆变得越来越复杂。使用稀有切点限制性酶(19,20)或同尾酶(21)的方法在将多个基因组装在单一载体中已取得一定成功，但不提供也(理论上)能够无限成长的真正灵活或模块化的组装系统。在克服这种限制并将组装过程标准化的尝试中，开发了被称为BioBrick标准的一套设计规则(22)，其中在DNA组装的背景中提出了幂等性的想法，其中对组分进行的反应产生新的结构，但该结构在其参与进一步反应的能力方面保持不变。然而，对于这些技术来说限制性位点瘢痕的存在可能构成问题，特别是在从较小片段组装基因时。更近些时候，已描述了基于金门克隆的模块化DNA组装技术(23)。金门克隆利用IIS型限制性酶识别非回文序列并在识别位点的一侧切割的能力，在单一(一锅)反应中将多个DNA片段无缝联结在一起。诸如GoldenBraid(24,25)、拓扑学等价TNT克隆(26)、MoClo(27,28)和Binder等人描述的质粒组装系统(29)的技术，已使用幂等性的想法来扩展金门克隆的原理，从而允许从较小片段的文库进行基因的模块化和组合装配，并随后在单个质粒中将多个基因组装在一起。在这些系统中，组装的方向由邻近片段和载体末端的IIS型单链突出端的相容性决定。因此，在多基因组装(即多个基因在单一载体中的组装)的水平上，只有一个组装方向是可能的，并且所述多基因质粒的生长(即其他基因的添加)只能发生在一个方向上(即是单向的)。尽管对于某些项目而言这可能不是问题，然而在某些情况下，这些单向模块化组装系统(UMAS)对可产生的多基因质粒的类型或者它们可以被构建的容易性施加了限制。先前描述的UMAS固有的多基因组装的单向本性施加限制的情况的一个实例，是在构建多基因组装体用于试验旨在通过同源重组整合到表达宿主染色体中的基因的表达时。在这个例子中，需要将感兴趣的基因置于两侧的左和右同源臂(其介导同源重组过程)之间。在先前描述的UMAS中，这只能通过两种方式实现：(i)使用可选克隆技术来构建新的载体，其中介导模块化组装的IIS型限制性位点和序列元件(被称为金门克隆盒)被置于两个同源臂之间。然而，这种对使用不同的克隆技术(即不使用用于多基因组装的基于金门的模块化组装系统)来构建新载体的需要，首先否定了使用模块化组装系统的原始益处。此外，每次要测试不同的染色体整合位点时，都需要构建新的载体(含有新的同源臂)，或者(ii)使用UMAS顺序装载第一同源臂，然后是感兴趣的基因，最后是第二同源臂。尽管这避免了(i)中描述的必须使用可选克隆技术的缺点，但它意味着染色体整合只能在已添加第二同源臂后实现。因此，在这些UMAS中，第二同源臂的添加有效地“封闭了”组装回路，使得任何进一步添加的基因总是位于所述同源臂之外。单向组装的缺点的另一个实例是UMAS固有的多基因组装的单向本性限制了许多这些位置排列可以被构建的速度和容易性。因此，尽管(单向)基于金门的模块化组装技术可用于构建某些类型的多基因组装体，但它们不提供完全灵活的组装方法。因此，在本领域中对在构建设计者多核苷酸和基因组装体中为用户提供灵活性的可选替的DNA组装系统，存在着需求。因此，本专利技术的目的是至少以某种方式来解决现有技术在提供模块化DNA组装系统中的缺陷，允许双向构建多基因组装体和/或至少为公众提供有用的选择。在本说明书中，在对专利说明书、其他外部文献或其他信息源做出引用时，这通常是出于为本专利技术的特点的讨论提供背景的目的。除非另有特别说明，否则对此类外部文献的引用不应被解释为承认此类文献或此类信息源在任何管辖范围内是先有技术或形成本领域公知常识的一部分。
技术实现思路
一方面，本专利技术涉及一种载体组，其包含至少两种穿梭载体V1和V2，其中V1选自V1.1(+)＝5’-A1B1M1B2C1C2A2-3’，V1.2(-)＝5’-A1C1C2B1M1B2A2-3’，V1.3(+)＝5’-A1B2M1B1C1C2A2-3’，和V1.4(-)＝5’-A1C1C2B2M1B1A2-3’，并且V2选自V2.1(+)＝5’-C1B1M1B2A1M2A2C2-3’，V2.2(-)＝5’-C1A1M2A2B1M1B2C2-3’，V2.3(+)＝5’-C1B2M1B1A1M2A2C2-3’，和V2.4(-)＝5’-C1A1M2A2B2M1B1C2-3’，其中M1是第一标记，M2是第二标记，并且A1、A2、B1、B2、C1和C2是限制性酶识别位点，其中至少A1、A2、C1和C2是IIS型限制性酶的识别位点，其中A1、B1和C1是全都不同的限制性位点，并且其中A1＝A2，C1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种载体组，其包含至少两种穿梭载体V1和V2，/n其中V1选自/nV1.1(+)＝5’-A1 B1 M1 B2 C1 C2 A2-3’，/nV1.2(-)＝5’-A1 C1 C2 B1 M1 B2 A2-3’，/nV1.3(+)＝5’-A1 B2 M1 B1 C1 C2 A2-3’，和/nV1.4(-)＝5’-A1 C1 C2 B2 M1 B1 A2-3’，/n并且V2选自/nV2.1(+)＝5’-C1 B1 M1 B2 A1 M2 A2 C2-3’，/nV2.2(-)＝5’-C1 A1 M2 A2 B1 M1 B2 C2-3’，/nV2.3(+)＝5’-C1 B2 M1 B1 A1 M2 A2 C2-3’，和/nV2.4(-)＝5’-C1 A1 M2 A2 B2 M1 B1 C2-3’，/n其中M1是第一标记，M2是第二标记，并且A1、A2、B1、B2、C1和C2是限制性酶识别位点，/n其中至少A1、A2、C1和C2是IIS型限制性酶的识别位点，/n其中A1、B1和C1是全都不同的识别位点，并且/n其中A1＝A2、C1＝C2并且B1＝B2或B1≠B2。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170929 AU 20179039551.一种载体组，其包含至少两种穿梭载体V1和V2，
其中V1选自
V1.1(+)＝5’-A1B1M1B2C1C2A2-3’，
V1.2(-)＝5’-A1C1C2B1M1B2A2-3’，
V1.3(+)＝5’-A1B2M1B1C1C2A2-3’，和
V1.4(-)＝5’-A1C1C2B2M1B1A2-3’，
并且V2选自
V2.1(+)＝5’-C1B1M1B2A1M2A2C2-3’，
V2.2(-)＝5’-C1A1M2A2B1M1B2C2-3’，
V2.3(+)＝5’-C1B2M1B1A1M2A2C2-3’，和
V2.4(-)＝5’-C1A1M2A2B2M1B1C2-3’，
其中M1是第一标记，M2是第二标记，并且A1、A2、B1、B2、C1和C2是限制性酶识别位点，
其中至少A1、A2、C1和C2是IIS型限制性酶的识别位点，
其中A1、B1和C1是全都不同的识别位点，并且
其中A1＝A2、C1＝C2并且B1＝B2或B1≠B2。


2.权利要求1所述的载体组，其包含至少三种、优选地至少四种、优选地至少五种、优选地至少六种、优选地至少七种、优选地八种不同的穿梭载体。


3.权利要求1或2所述的载体组，其中A1、A2、B1、B2、C1和C2包含至少四种、优选地至少六种IIS型限制性位点，优选地其中所述IIS型限制性位点选自BsaI、AarI、BsmBI、AcuI、AlwI、BaeI、BbsI、BbvI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MboII、MlyI、MmeI、MnlI、NmeAIII、PleI、SapI、SfaNI位点，优选地A1和A2是AarI限制性位点，优选地B1和B2是BsaI限制性位点，和/或优选地C1和C2是BsmBI限制性位点。


4.权利要求1至3中任一项所述的载体组，其还包含源载体或终载体或两者，优选地其中所述终载体包含与A1和A2或与C1和C2相同的一对限制性位点，其中所述终载体任选地包含侧翼带有所述一对限制性位点的标记(DM)，其中所述DM在存在时，与所述V2穿梭载体中的M2相同。


5.权利要求1至4中任一项所述的载体组，其包含如下的至少四种穿梭载体：
(a)至少两种V1载体和至少两种V2载体，
(b)至少一种V1载体和至少三种V2载体，或
(c)至少三种V1载体和至少一种V2载体，
其中(a)、(b)和(c)各自包含至少一种(-)载体和至少一种(+)载体，
优选地包含如下的至少五种穿梭载体：
(d)至少两种V1载体和至少三种V2载体，
(e)至少三种V1载体和至少两种V2载体，
(f)四种V1载体和至少一种V2载体，或
(g)至少一种V1载体和四种V2载体，
其中(d)、(e)、(f)和(g)各自包含至少一种(-)载体和至少一种(+)载体，
优选地包含如下的至少六种穿梭载体：
(h)至少三种V1载体和至少三种V2载体，
(i)四种V1载体和至少两种V2载体，
(j)至少两种V1载体和四种V2载体，
其中(i)和(j)各自包含至少一种(-)载体和至少一种(+)载体，
优选地包含如下的至少七种穿梭载体：
(k)至少三种V1载体和四种V2载体，
(l)四种V1载体和至少三种V2载体。


6.权利要求1至5中任一项所述的载体组，其包含V1.1(+)、V1.2(-)、V1.3(+)、V1.4(-)、V2.1(+)、V2.2(-)、V2.3(+)andV2.4(-)。


7.权利要求6所述的载体组，其中V1.1(+)是包含SEQIDNO：122的pML2(+)WF；V1.2(-)是包含SEQIDNO：123的pML2(-)WR；V1.3(+)是包含SEQIDNO：124的pML2(+)WR；V1.4(-)是包含SEQIDNO：125的pML2(-)WF；V2.1(+)是包含SEQIDNO：126的pML2(+)BF；V2.2(-)是包含SEQIDNO：127的pML2(-)BR；V2.3(+)is是包含SEQIDNO：128的pML2(+)BR；并且V2.4(-)是包含SEQIDNO：129的pML2(-)BF。


8.权利要求1至7中任一项所述的载体组，其中在V1.1(+)、V1.2(-)、V1.3(+)和V1.4(-)中A1和A2相对于彼此趋同取向，优选地其中在V2.1(+)、V2.2(-)、V2.3(+)和V2.4(-)中A1和A2相对于彼此趋异取向，优选地其中在V1.1(+)、V1.2(-)、V1.3(+)和V1.4(-)中C1和C2相对于彼此趋异取向，优选地其中在V2.1(+)、V2.2(-)、V2.3(+)和V2.4(-)中C1和C2相对于彼此趋同取向。


9.权利要求1至8中任一项所述的载体组，其中所述载体组中的载体是克隆系统中的组分，优选地其中所述克隆系统可用于制造包含至少一个转录单位(TU)的基因构建物。


10.一种包含至少两个转录单位(TU)的多基因构建物的制造方法，所述方法包括：
(a)将包含以下述顺序排列的第一转录单位(TU1)和四个限制性位点A1、A2、C1和C2的第一克隆盒：
5’-A1-TU1-C1-C2-A2-3’，或
5’-A1-C1-C2-TU1-A2-3’，
克隆到在第二标记(M2)两侧包含一对限制性位点A1和A2的终载体(V3)中，以制造：
包含5’-TU1-C1-C2-3’的终载体V3.1或
包含5’-C1-C2-TU1-3’的终载体V3.2，
(b)将包含以下述顺序排列的第二转录单位(TU2)、第二标记(M2)和四个限制性位点A1、A2、C1和C2的第二克隆盒：
5’-C1-TU2-A1-M2-A2-C2-3’，或
5’-C1-A1-M2-A2-TU2-C2-3’，
克隆到V3.1中，以制造包含5’-TU1-TU2-A1-M2-A2-3’的终载体V4.1或包含5’-TU1-A1-M2-A2-TU2-3’的终载体V4.2，或
克隆到V3.2中，以制造包含5’-TU2-A1-M2-A2-TU1-3’的终载体V4.3或包含5’-A1-M2-A2-TU2-TU1-3’的终载体V4.4，
其中A1和C1是不同的限制性位点，并且
其中A1＝A2并且C1＝C2。


11.权利要求10所述的方法，其中V3.1基本上由5’-TU1-C1-C2-3’构成，优选地其中V3.2基本上由5’-C1-C2-TU1-3’构成，优选地其中V4.1基本上由5’-TU1-TU2-A1-M2-A2-3’构成，优选地其中V4.2基本上由5’-TU1-A1-M2-A2-TU2-3’构成，优选地其中V4.3基本上由5’-TU2-A1-M2-A2-TU1-3’构成，优选地其中V4.4基本上由5’-A1-M2-A2-TU2-TU1-3’构成。


12.权利要求10或权利要求11所述的方法，其中当第一克隆盒被克隆到V3中以制造V3.1或V3.2时，A1和...

【专利技术属性】
技术研发人员：E·J·帕克，M·J·尼古尔森，C·J·范·杜勒维勒，
申请(专利权)人：维多利亚联结有限公司，
类型：发明
国别省市：新西兰;NZ