对松墨天牛等墨天牛属昆虫具有高毒力的Bt毒素制造技术

本发明专利技术涉及生物防治领域，具体涉及一种对松墨天牛等墨天牛属昆虫具有高毒力的Bt毒素。所述Bt毒素为毒素BRC1912，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，该毒素对松墨天牛等墨天牛属昆虫具有良好的杀虫活性，本发明专利技术为松墨天牛等墨天牛属的害虫防控提供了有效途径。

【技术实现步骤摘要】
对松墨天牛等墨天牛属昆虫具有高毒力的Bt毒素
本专利技术涉及林业害虫的生物防治领域，具体涉及一种对松墨天牛等墨天牛属昆虫具有高毒力的Bt毒素。
技术介绍
在林业上，鞘翅目天牛科墨天牛属昆虫是松材线虫的主要传播媒介（Motaetal.,2008;Futai,2013），也是主要的蛀干害虫，又被称为次期性害虫，生活在韧皮部或者木质部之中。在韧皮部啃食输导组织，阻止树木对养分的吸收，在木质部啃食边材，对水分的运输造成阻碍，不严重的会造成树木发育不良，严重的导致树木整株坏死。蛀干害虫由于其生活习性，除了成虫会在树外活动，其它虫态几乎都生活在树木的韧皮部或者是木质部中，极其隐蔽，也较难防治。鉴于当前的防治方法效果不佳，其中生物防治具有绿色环保，持效期长的优点，进一步寻找有效的微生物制剂对松墨天牛等墨天牛属昆虫进行生物防治，对于遏制松材线虫病的扩散蔓延具有重要的意义。苏云金芽胞杆菌（简称Bt）是一种昆虫病原微生物，对16个目3000多种害虫有活性，被广泛地应用于农、林和卫生害虫的生物防治中（Adangetal.，2014）。Bt的杀虫活性主要依赖于其在芽胞期产生的伴孢晶体蛋白（简称ICPs），主要是Cry毒素（Deistetal.,2014）。不同类别的Cry毒素的杀虫谱表现出显著的特异性，如Cry1、Cry9、Cry15类毒素对鳞翅目昆虫有效，Cry3、Cry7、Cry8和Cry34/35类毒素对鞘翅目的幼虫有活性（Bravo,1997）。其中，有报道表明，Cry3A类毒素对天牛科幼虫有效，但其杀虫活性不高（Chenetal.,2005）。因此，为有效防治天牛科墨天牛属昆虫，迫切需要解决Cry3A毒素对其弱毒的问题。在Cry3Aa毒素作用过程中，当其被昆虫摄取后，原毒素会被昆虫肠道蛋白酶酶解活化出55kDa大小的活性片段，该片段对鞘翅目昆虫表现出杀虫活性（Walteretal.,2008;Lietal.,2011）。然后，单体的活性毒素寡聚化形成的低聚物与中肠上皮细胞刷状缘膜囊泡（BBNV）上的受体结合，从而引起膜穿孔并导致细胞死亡（Pardo-Lópezetal.,2013）。而有研究表明，天牛肠道蛋白酶主要为胰蛋白酶，然而，73kDaCry3Aa毒素无法被天牛的肠道蛋白酶有效酶解活化出55kDa的活性片段，即存在酶解活化障碍。已有研究证明Cry3Aa原毒素domainI的α-helix3和α-helix4之间的loop区域是被蛋白酶切割释放活性片段的区域，而在该区域缺乏胰蛋白酶的识别位点（Oppertetal.,1997）。此外，还发现55kDa的Cry3Aa活性片段很容易被胰蛋白酶过度酶解为较小短肽，从而使得毒素对天牛失去活性。这表明在Cry3Aa毒素的其他结构域中存在较多的能够被胰蛋白酶识别的位点，从而使得毒素被过度酶解。这些结果表明昆虫肠道蛋白酶对Cry3A毒素的酶解活化障碍和过度酶解是造成其对目标昆虫弱毒的主要原因。因此，为解决昆虫肠道蛋白酶对毒素的酶解活化障碍和过度酶解现象，本专利技术以cry3Aa2基因为对象，通过分子改造的手段对毒素中的胰蛋白酶识别位点进行突变，开发能够产生对墨天牛属昆虫具有高毒力的新型Cry毒素，是一项具有重大意义和应用价值的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种对松墨天牛等墨天牛属昆虫具有高毒力的Bt毒素，以SEQIDNO.4（Cry3Aa2）为支架毒素蛋白，通过分子改造的手段对毒素中的胰蛋白酶识别位点进行突变，开发能够产生对墨天牛属昆虫具有高毒力的新型Cry毒素。为实现上述目的，采用以下技术方案：对墨天牛属昆虫具有高毒力的Bt毒素，所述Bt毒素为毒素BRC1912蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。一种编码如所述Bt毒素的基因，所述基因其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。与在SEQIDNO:4所列出的毒素Cry3Aa2蛋白（其基因序列如SEQIDNO.3所示）的初始氨基酸序列相比，为促进昆虫肠道蛋白酶将毒素酶解活化出更多的55kDa大小的活性片段，本专利技术的BRC1912蛋白的结构域I中的α-helix3和α-helix4之间的loop区域“缬氨酸-丝氨酸-丝氨酸”（第155和第157个氨基酸之间的序列）替换为短肽序列“苯丙氨酸-甲硫氨酸-精氨酸”，增加了胰蛋白酶的识别位点精氨酸（图1）。与在SEQIDNO:4所列出的毒素Cry3Aa2蛋白的初始氨基酸序列相比，为克服昆虫肠道蛋白酶对毒素的过度酶解，本专利技术的BRC1912蛋白中包括了五个位点的氨基酸突变，将五个胰蛋白酶的识别位点突变为不被识别的丙氨酸，分别为：结构域I中在位置65处由赖氨酸置换成丙氨酸，在位置70处由赖氨酸置换成丙氨酸，在位置231处由赖氨酸置换成丙氨酸，结构域II中在位置468处由赖氨酸置换成丙氨酸，以及结构域III中在位置596处由赖氨酸置换成丙氨酸（图1）。结构域I的基因序列和氨基酸序列分别如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；结构域II基因序列和氨基酸序列分别如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示；结构域III基因序列和氨基酸序列分别如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示。所述的毒素BRC1912的三个结构域，这三个结构域中的任意一个结构域均可与Bt毒素的其他家族毒素的结构域任意组合获得对鞘翅目具有高毒力的毒素。所述的Bt毒素的其他家族毒素，这些毒素均具有三级结构域，包括但不限于Cry3、Cry7、Cry8类毒素。所述对墨天牛属昆虫具有高毒力的Bt毒素在防治天牛科墨天牛属昆虫中的应用。所述墨天牛属昆虫包括松墨天牛（Monochamusalternatusenda、Monochamusalternatusalternatus）、云杉花墨天牛（Monochamussaltuarius）、云杉小墨天牛（Monochamussutor）、卡来罗纳黑天牛（Monochamuscarolinensis）、密毛白点墨天牛（Monochamusscutellatus）和松墨斑墨天牛（Monochamusmutator）和樟子松墨天牛（Monochamusgalloprovincialis）。所述的对墨天牛属昆虫具有高毒力的Bt毒素在防治鞘翅目害虫中的应用。所述鞘翅目害虫包括赤拟谷盗（Triboliumcastaneum）、红棕象甲（Rhynchophorusferrugineus）、椰心叶甲（Brontispalongissima）、星天牛（Anoplophorachinensis）、光肩星天牛（Anoplophoraglabripennis）和云斑天牛（Batocerahorsfieldi）。本专利技术的BRC1912晶体蛋白用于墨天牛属昆虫及其他鞘翅目昆虫的生物测定。在具体实施例中，优选地用于防治松墨天牛（Monochamusalternatusalternatus）、云杉花墨天牛（Monochamussaltuarius）、云杉小墨天牛（Monochamussutor）、光肩本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.对墨天牛属昆虫具有高毒力的Bt毒素，其特征在于，所述Bt毒素为毒素BRC1912，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，是一种有支架毒素蛋白工程化的毒素。/n

【技术特征摘要】
20200518 CN 20201042050251.对墨天牛属昆虫具有高毒力的Bt毒素，其特征在于，所述Bt毒素为毒素BRC1912，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，是一种有支架毒素蛋白工程化的毒素。


2.根据权利要求1所述的Bt毒素，其特征在于：所述支架毒素蛋白其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。


3.根据权利要求1所述的Bt毒素，其特征在于：其在选自SEQIDNO.4所示的支架蛋白中的三个结构域中至少包含一个氨基酸的取代。


4.根据权利要求1所述的Bt毒素，其特征在于：其中取代方案为：
（1）结构域I中氨基酸取代：在位置65处由赖氨酸置换成丙氨酸，在位置70处由赖氨酸置换成丙氨酸，在位置231处由赖氨酸置换成丙氨酸，在位置155到157处由“缬氨酸-丝氨酸-丝氨酸”置换成“苯丙氨酸-甲硫氨酸-精氨酸”，结构域I的基因序列和氨基酸序列分别如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；
（2）结构域II中氨基酸取代：在位置468处由赖氨酸置换成丙氨酸，结构域II基因序列和氨基酸序列分别如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示；
（3）结构域III中氨基酸取代：在位置596处由赖氨酸置换成丙氨酸，结构域III基因序列和氨基酸序列分别如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示。


5.一种编码如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴松青，张飞萍，郭雅洁，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建;35