一种杀虫蛋白及其核酸、制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种杀虫蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的至少一种。这些蛋白质具有一致的杀虫谱，均对大猿叶甲、小猿叶甲、黄曲条跳甲、榆蓝叶甲和马铃薯甲虫等鞘翅目害虫具有良好的杀虫活性，特别是氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的蛋白的杀虫效果尤为突出。

Insecticidal protein and its nucleic acid, preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种杀虫蛋白及其核酸、制备方法和应用本专利技术为于2016年9月21日提交的专利技术名称为一种杀虫蛋白及其核酸、制备方法和应用，申请号为201610836625.0的专利申请的分案。
本专利技术涉及杀虫蛋白领域。
技术介绍
鞘翅目害虫在我国农业生产中的危害逐年加重，且造成了严重的经济损失，因此，急需发掘更多的对鞘翅目害虫具有毒杀作用的菌株及基因。目前，从苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)中发现了一些的Cry蛋白对鞘翅目害虫具有杀虫活性。然而，为了丰富生物防治的种类，特别是蛋白对鞘翅目害虫防治的种类，以期获得具有不同杀虫机理的生物防治材料，来应对因长期使用某单一药剂可能产生的抗药性。因此，仍然有必要寻找新的具有优良活性的新型杀虫蛋白。
技术实现思路
本专利技术之一提供了一种不同于现有技术的新型的杀虫蛋白，其氨基酸序列为如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示的至少一种。根据本专利技术的发现，这些蛋白质具有一致的杀虫谱，例如它们均对大猿叶甲、小猿叶甲、黄曲条跳甲、榆蓝叶甲和马铃薯甲虫等鞘翅目害虫具有良好的杀虫活性，特别是氨基酸序列如SEQIDNo.4所示的蛋白的杀虫效果尤为突出。在一个具体实施方式中，所述杀虫蛋白为氨基酸序列如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示的至少一种的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且与氨基酸序列如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示的蛋白中的至少一种具有相同功能的蛋白。专利技术人在研究过程中，对其中对鞘翅目害虫杀虫活性突出的蛋白(如SEQIDNo.4所示)进行了一系列的截短，以期提高该序列的活性。最后，经实验证实，氨基酸序列如SEQIDNo.7所示的截短蛋白获得了较野生型序列(如SEQIDNo.4所示)更优的杀虫效果。因此，在一个优选的具体实施方式中，所述杀虫蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.7所示。本专利技术之二提供了一种能够翻译为本专利技术之一的杀虫蛋白的核酸。在一个具体实施方式中，能够翻译为如SEQIDNo.1所示的氨基酸序列的核酸的序列如SEQIDNo.8所示，能够翻译为如SEQIDNo.2所示的氨基酸序列的核酸的序列如SEQIDNo.9所示，能够翻译为如SEQIDNo.3所示的氨基酸序列的核酸的序列如SEQIDNo.10所示，能够翻译为如SEQIDNo.4所示的氨基酸序列的核酸的序列如SEQIDNo.11所示，能够翻译为如SEQIDNo.5所示的氨基酸序列的核酸的序列如SEQIDNo.12所示，能够翻译为如SEQIDNo.6所示的氨基酸序列的核酸的序列如SEQIDNo.13所示，能够翻译为如SEQIDNo.7所示的氨基酸序列的核酸的序列如SEQIDNo.14所示。本专利技术之三提供了一种制备杀虫晶体蛋白的方法，其包括如下步骤：在活体生物中表达本专利技术之一的杀虫蛋白；特别是在含有本专利技术之二的核酸的活体生物中表达本专利技术之一的杀虫蛋白。本领域的技术人员熟知每一个三联体密码相对应于一种氨基酸编码，而一种氨基酸则有可能相对应于多个三联体密码，因此，在氨基酸序列一定的情况下，可以存在与其对应的多种DNA序列。在一个具体实施方式中，所述活体生物在16-20℃下表达所述杀虫蛋白。在一个具体实施方式中，所述活体生物为微生物，进一步地，所述微生物为野生微生物和/或遗传工程微生物。在一个具体实施方式中，所述活体生物为芽胞杆菌(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、肠杆菌(Escherichia)和酵母(Saccharomyces)中的至少一种。在一个优选的具体实施方式中，所述芽胞杆菌为苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)、枯草芽胞杆菌(Bacilllussubtilis)、萎缩芽胞杆菌(Bacillusatrophaeus)和蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)中的至少一种；所述假单胞菌包括荧光假单胞杆菌(Pseudomonasfluorescens)；所述肠杆菌包括大肠杆菌(Escherichiacoli)。在一个具体实施方式中，在所述活体生物中表达所述杀虫蛋白后，还包括从所述活体生物中纯化所述杀虫蛋白的步骤。其中纯化的方式可通过本领域技术人员所知晓的常规方法实现。本专利技术之四提供了本专利技术之一的杀虫蛋白在防治有害生物中的应用。在一个具体实施方式中，本专利技术之四中所述有害生物为昆虫中的至少一种。在一个具体实施方式中，本专利技术之四中所述有害生物为鞘翅目昆虫中的至少一种。在一个具体实施方式中，本专利技术之四中所述有害生物为大猿叶甲(ColaphellusbowringiiBaly)、小猿叶甲(PhaedonbrassicaeBaly)、黄曲条跳甲(Phyllotretastriolata)、榆蓝叶甲(Pyrrhaltaaenescens)和马铃薯甲虫(Leplinotarsadecernlineata)中的至少一种。本专利技术之五提供了本专利技术之二的核酸在构建防治有害生物的转基因植物中的应用。通过构建所述转基因植物，本专利技术之一的杀虫蛋白能够在所述转基因植物中表达，或者进一步地在所述转基因植物中的特定组织中表达，在有害生物为害该转基因植物时，由于食用表达所述杀虫蛋白的植株，而被毒杀或者被抑制生长，从而达到防治有害生物的目的。在一个具体实施方式中，为核酸在构建防治鞘翅目昆虫中的至少一种的转基因植物中的应用。在一个具体实施方式中，为核酸在构建防治大猿叶甲(ColaphellusbowringiiBaly)、小猿叶甲(PhaedonbrassicaeBaly)、黄曲条跳甲(Phyllotretastriolata)、榆蓝叶甲(Pyrrhaltaaenescens)和马铃薯甲虫(Leplinotarsadecernlineata)中的至少一种的转基因植物中的应用。附图说明图1为在可溶组分(上清)中目标基因表达产物的SDS-PAGE分析。其中，LM：低分子量蛋白参照；1：Rosetta-pET21b(阴性对照)；2：Rosettaip1；3：Rosetta-ip1；4：Rosetta-ip1；5：Rosetta-ip1；6：Rosetta-ip1；7：Rosetta-ip1。图2为不可溶组分(沉淀)中目标基因表达产物的SDS-PAGE分析。其中，LM：低分子量蛋白参照；1：Rosetta-pET21b(阴性对照)；2：Rosettaip1；3：Rosetta-ip1；4：Rosetta-ip1；5：Rosetta-ip1；6：Rosetta-ip1；7：Rosetta-ip1。图3为截短基因表达情况的SDS-PAGE分析。其中，LM：低分子量蛋白参照；1：Ro本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种杀虫蛋白在防治有害生物中的应用，所述杀虫蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.6所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种杀虫蛋白在防治有害生物中的应用，所述杀虫蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.6所示。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述有害生物为大猿叶甲(ColaphellusbowringiiBaly)、小猿叶甲(PhaedonbrassicaeBaly)、黄曲条跳甲(Phyllotretastriolata)、榆蓝叶甲(Pyrrhaltaaenescens)和马铃薯甲虫(Leplinotarsadecernlineata)中的至少一种。


3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述杀虫蛋白在活体生物中在16-20℃下表达。


4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述杀虫蛋白在含有能够翻译为如SEQIDNo.6所示的氨基酸序列的核酸的活体生物中表达。


5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，能够翻译为如SEQIDNo.6所示的氨基酸序列的核酸的序列如SEQIDNo.13所示。


6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述活体生物为微生物；
优选地，所述活体生物为芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、肠杆菌(Escherichia)和酵母(Saccharomyces)中的至少一种；
优选地，所述活体生物为苏云金芽孢杆菌(Bacillusthur...

【专利技术属性】
技术研发人员：张杰，束长龙，耿丽丽，李艳秋，曹蓓蓓，彭琪，宋福平，梁影屏，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11