一种植物抗虫基因及其载体和应用制造技术

本申请公开了一种人工合成用于转基因抗虫植物的Bt杀虫基因mCry1Ab以及用于植物抗虫的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其编码基因的核酸序列为SEQ ID NO 3。本申请还公开了相应的载体，以及蛋白质、基因在抗虫害中的应用。本申请改造后的mCry1Ab基因解决了Cry1Ab基因容易断裂，以及重组和抗性差的问题，并且相对于Cry1Ab基因具有更佳的抗虫效果。

A plant insect resistant gene and its vector and Application

【技术实现步骤摘要】
一种植物抗虫基因及其载体和应用
本申请涉及基因工程生物防治
，具体而言涉及人工改造的抗虫基因mCry1Ab、其表达载体及应用。
技术介绍
Bt基因编码杀虫晶体蛋白，来自苏云金芽孢杆菌(BacillusthuringHansis)。在其芽孢形成过程中会产生δ-内毒素的杀虫伴胞晶体蛋白，这些蛋白具有很高的杀虫活性。其作用原理为这种抗虫蛋白能被碱性肠液溶解，水解为更小的活性毒素片段-核心片段(Hofte和Whiteley，1989)。该活性片段能抗蛋白酶的进一步水解，被激活的蛋白质结合在昆虫肠道上的刷状小泡上，引起穿孔从而影响渗透平衡，细胞膨胀并溶解，靶标生物停止取食并最后死亡。研究表明许多靶标害虫的肠道上皮细胞都具有Bt蛋白高亲和性的结合位点(Hofte和Whiteley，1989)。在过去的几十年里，已确定数十种苏云金芽孢杆菌菌系及130多种它们编码的杀虫晶体蛋白。1986年，首批转基因植物(抗虫、抗除草剂)被批准进入田间试验。1987年，比利时Vaeck等人首次获得转Bt杀虫蛋白的抗虫烟草，但只能检测到微弱的抗虫性，其表达蛋白几乎检测不到，只占可溶性蛋白的0.001％。同年又有两次获得Bt转基因植株的报道(Barton等，1987；Fischhoff等，1987)。1989年哺乳动物抗体重链和轻链基因在烟草中成功表达并正确组装成有功能的抗体。到1990年，至少有7个研究小组获得Bt转基因植物并应用于大田试验(EstruchJ等，1996)。Adang等(1993)改造了Cry3A基因，该基因在马铃薯中高效表达。1993年，Michael等人对Cry1Ab基因进行改造，获得Bt转基因植株，对玉米螟有很好的抗性。KozHal(1993)等培育出了抗虫转基因玉米，转基因植株能高水平表达Cry1A(b)抗虫基因。1996年，JoachimW等人将Cry1Ab进行截短修饰，转化水稻，获得转Bt水稻，靶标害虫死亡率达100％。1998年，Cheng等人根据植物所偏爱的密码子，改造了Cry1Ab和Cry1Ac基因用农杆菌转化法转化水稻获得转基因植株，R2代虫试，5天内有100％致死率。Bohotova等(2001)人工改造合成Cry1B基因，转化热带玉米得到转基因玉米能有效防治玉米螟。我国对Bt杀虫蛋白基因的研究主要是：1992年，郭三堆等人采用植物优化密码子方法首先在国内人工合成全长1824bp的GFMCry1A杀虫基因，获得了中国第一代单价抗虫棉。丁群星等(1993)和王国英等(1995)分别用子房注射法和基因枪法将pB48.415质粒转入玉米愈伤组织中获得转基因植株，抗虫性测定表明其具有一定抗虫性。1994年，中国农业大学在国内外首次用子房注射的方法把抗虫基因Bt转入玉米并获得转基因植株，以自主知识产权基因Bt为代表的抗虫玉米已展示了良好的开发前景。1998年，中国农业科学院将GFM杀虫基因构建到pMG6质粒上，导入到玉米中(周逢勇等，1998)，后代检测表明Bt基因以孟德尔遗传方式遗传到下一代(LiuYJ等，2003)。我国在转基因技术研究方面，已经建立了比较成熟的玉米转基因技术体系。Cry1Ab蛋白是一类由苏云金芽孢杆菌产生的对鳞翅目害虫具有毒杀作用的伴胞晶体，其在生物防治领域具有重要的应用前景，因而对其也有广泛的研究。为了解决苏云金杆菌δ-内毒素基因Cry1Ab来源于微生物，其转基因植物存在表达量低、表达产物不稳定、抗虫性效果差等问题，在公开号为CN102010873A和CN102094030A的中国专利申请中，分别通过改造碱基序列提高GC含量能提高其在转基因植物中的表达量，达到杀虫目的，具体地，专利技术人通过比较苏云金芽孢杆菌和玉米的密码子使用情况，发现两者在密码子偏好上存在很大差异，利用植物的偏好密码子，重新设计和改造Cry1Ab并获得新型抗虫基因Cry1Ab-Ma，以实现转新基因作物具有较好的抗虫性。类似的，在公开号为CN107383177A的中国专利申请中，专利技术人对Cry1Ab蛋白的活性区域进行了细致的分析，在保证进一步提高其表达水平的前提下，按照单子叶植物编码特征对Cry1Ab蛋白进行了基因编码框及密码子改造，以解决原始的基因不能在植物中高效表达，达不到植物保护的要求的问题，并将改造后的Cry1Ab蛋白命名为mCry1Ab蛋白。在实践中，上述基因虽然能够在玉米中表达，但是Cry1Ab基因存在易断裂的问题，并且还存在重组和抗性差的问题。
技术实现思路
针对上述技术问题，本申请的目的在于提供一种截短后的mCry1Ab基因，改造后的mCry1Ab基因以解决Cry1Ab基因容易断裂，以及重组和抗性差的问题。为实现上述目的，本申请提供一种用于植物抗虫的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列为SEQIDNO:1。该mCry1Ab杀虫蛋白质的氨基酸序列仅含有818个氨基酸残基，远远少于含有1155个氨基酸残基的Cry1Ab杀虫蛋白质，更易于在细胞中表达，且具有更强效的杀虫抗虫效果。该Cry1Ab杀虫蛋白质的氨基酸序列为SEQIDNO:2。本申请还公开了一种抗虫基因，所述抗虫基因包含编码上述的蛋白质的基因序列。在根据本专利技术的一个实施方案中，所述抗虫基因的核苷酸序列为SEQIDNO:3。该改造后的截短后的mCry1Ab基因mCry1Ab含有2457个核苷酸，远远少于含有3468个核苷酸的Cry1Ab基因，该Cry1Ab基因的序列为SEQIDNO:4。截短后的mCry1Ab基因相比Cry1Ab基因更不容易断裂，在遗传重组中更易于得到传递。本专利技术还公开了一种含有上述抗虫基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。通过构建相应的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系使该抗虫基因能够应用于实践中，有利于防止农业虫害。本专利技术还公开了一种表达载体，所述表达载体包上述的抗虫基因。在根据本专利技术的一个实施方案中，该表达载体，中依次包含以下基因结构：花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子(pr35s)；抗虫基因；胭脂碱合成酶的终止子(Nos)；玉米泛素基因启动子(Ubi)；磷酸甘露糖异构酶基因(PAT)；自花椰菜花叶病毒(CaMV)的终止子(PAT)。本专利技术进一步公开了用于植物抗虫的蛋白质，或者，所述抗虫基因，或，含有所述抗虫基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在植物抗虫中的应用，所述应用选自以下两者或两者之一：a)制备具有抗虫效果的药剂；c)培育具有或提高抗虫能力的转基因植物。在根据本专利技术一个实施方案中，所述应用中防治的害虫选自亚洲玉米螟、东方黏虫、棉铃虫、甜菜夜蛾和草地贪夜蛾中的一种或多种。本专利技术还进一步公开了一种培育具有或提升了抗虫能力的植物的方法，所述方法包括如下步骤：将上述抗虫基因导入受体植物中，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比，所述转基因植物的抗虫性增强。在根据本专利技术的一个实施方案中所述植物选自单子叶植物、双子叶植物、禾本科植物中的一种或多种；优选为玉米。本专利技术具有以下有益效果：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于植物抗虫的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于植物抗虫的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列为SEQIDNO:1。


2.一种抗虫基因，其特征于，所述抗虫基因包含编码如权利要求1所述的蛋白质的基因序列。


3.如权利要求2所述的抗虫基因，其特征在于，所述抗虫基因的核苷酸序列为SEQIDNO:3。


4.一种含有如权利要求2或3所述抗虫基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。


5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含如权利要求2所述的抗虫基因。


6.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体中依次包含以下基因结构：
花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子(pr35s)；抗虫基因；胭脂碱合成酶的终止子(Nos)；玉米泛素基因启动子(Ubi)；磷酸甘露糖异构酶基因(PAT)；自花椰菜花叶病...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘枫，贾志伟，王强，李树秀，李晓娇，李涛，赵丽媛，张原，吕玉平，
申请(专利权)人：隆平生物技术海南有限公司，
类型：发明
国别省市：海南;46