一种杀虫蛋白、其核苷酸序列及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种杀虫蛋白、其核苷酸序列及其应用。本实验室从从北京百望山森林公园的土样分离得到的B4F11菌株(保藏号CGMCC NO.18611)，从该菌株中得到一个1个基因的阳性克隆，通过纯化，检测，得到该蛋白编码基因共380氨基酸，如SEQ ID NO：1所示，编码基因一共1143碱基，基因序列如SEQ ID NO：2所示。将克隆得到的基因进行表达，蛋白功能验证显示该蛋白对三种稻飞虱有很强的毒杀作用，尤其是对灰飞虱。蛋白浓度为30ppm，三种稻飞虱校正死亡率均达90％，对于水稻中稻飞虱害虫的防治有很好的应用前景。

A insecticidal protein, its nucleotide sequence and its application

【技术实现步骤摘要】
一种杀虫蛋白、其核苷酸序列及其应用
本专利技术涉及生物防治
，特别是进一步，本专利技术涉及一种对稻飞虱农业害虫具有高毒力杀虫基因及由该基因所编码的蛋白质，以及该杀虫蛋白在防治稻飞虱中的应用。
技术介绍
水稻是我国三大主粮作物之一，其安全生产关系着国计民生。稻飞虱是水稻上重要的刺吸式口器害虫，其主要包括灰飞虱(Laodelphaxstriatellus)、褐飞虱(Nilaparvatalugens)以及白背飞虱(Sogatellafurcifera)三大类群。此类害虫属于半翅目飞虱科，主要通过刺吸式口器刺吸水稻等作物汁液，掠夺其营养物质，造成空秕率上升，千粒重下降，稻米品质降低。危害较重的是褐飞虱和白背飞虱，早稻前期以白背飞虱为主，后期以褐飞虱为主；中晚稻以褐飞虱为主。此外，稻飞虱还是水稻、玉米等禾本科作物病毒病的主要传毒介体。灰飞虱传播条纹叶枯病和黑条矮缩病，褐飞虱传播齿叶矮缩病和草状矮化病，白背飞虱传播南方黑条矮缩病。灰飞虱以华北、华东和华中稻区发生较多，在田间以穗期为害最严重，华北地区每年发生4～5代，长江中、下游5～6代，福建7～8代。灰飞虱以若虫在华北地区杂草丛、稻桩或落叶下越冬，在浙江以若虫在麦田杂草上越冬，在福建南部各虫态皆可越冬。褐飞虱在中国北方各稻区均有分布，各虫态皆可越冬。在长江流域以南各省发生较烈，每年发生4～11代，部分地区世代重叠。白背飞虱与褐飞虱分布基本相同，以长江流域为主，以卵在自生苗和游草上越冬，每年发生3～8代，为害单季中、晚稻和双季早稻较重。目前此类害虫的防治主要依赖于化学农药防治，如毒死蜱、吡虫啉、马拉硫磷、吡蚜酮、醚菊酯等，但是化学农药的长期滥用带来了害虫抗药性上升、农药残留、环境污染、食品安全等一系列严重后果，急需挖掘对此类害虫具有高效杀虫活性的蛋白用于生物防治以及转基因植物。
技术实现思路
针对上述领域中的缺陷，本专利技术提供了一种新的杀虫蛋白，对稻飞虱具有毒杀作用，且对常见的褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱三种稻飞虱均有较强的毒杀作用，对于水稻的防治有较好的应用前景。一种杀虫蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。编码上述杀虫蛋白的基因。所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。所述杀虫蛋白在毒杀稻飞虱害虫中的应用。所述应用为将杀虫蛋白作为杀虫活性成分制作杀虫剂对稻飞虱进行杀灭。所述应用为将表达杀虫蛋白的基因转入稻飞虱的寄主植物，使该植物表达对稻飞虱害虫的抗性。所述害虫为灰飞虱、褐飞虱或白背飞虱。本实验在高通量筛选与分离苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)菌株资源的基础上，从北京百望山森林公园的土样中分离得到的B4F11菌株(保藏号CGMCCNO.18611)，该菌株在芽胞形成期产生了类椭球体状的伴胞晶体，被鉴定为苏云金芽孢杆菌。提取该菌株的晶体总蛋白，生测表明该菌株对灰飞虱具有一定的杀虫活性。从该菌株基因组中得到一个基因的阳性克隆，分析结果证明所克隆的基因为新基因，命名为Gene1，通过纯化，检测，得到该蛋白编码基因共380氨基酸，如SEQIDNO：1所示，分子量42539.9道尔顿；编码基因一共1143碱基，具体信息如下：Composition434A；202C；192G；315T；0OTHERPercentage:38.0％A；17.7％C；16.8％G；27.6％T；0.0％OTHER编码该蛋白的基因序列如SEQIDNO：2所示。将克隆得到的基因进行表达，蛋白功能验证显示该蛋白对三种稻飞虱均有很强的毒杀作用，尤其是对灰飞虱。蛋白浓度为30ppm，三种稻飞虱校正死亡率均达90％，对于水稻中稻飞虱害虫的防治有很好的应用前景。菌株保藏信息：B4F11菌种分类命名：苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏日期：2019年9月23日保藏编号：CGMCCNO.18611保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。附图说明图1，Rosetta菌株中诱导表达结果。其中M的分子量marker；1，空白对照(指含有pET21b空载体)可溶性组分；2，含有杀虫基因载体(含有pET21b+Gene1载体)的可溶性组分；3，空白对照不可溶性组分；4，含有杀虫基因载体的不可溶性组分；箭头显示的是目标杀虫蛋白表达条带。图2，纯化Gene1蛋白电泳结果其中M的分子量marker；1，纯化的含有杀虫基因载体(含有pET21b+Gene1载体)的可溶性组分。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细说明。1、生测体系的建立与验证生测方法参照Fu等报道的生测方法，并加以改进。新的生测体系的建立在原有的生测体系的基础上，经过多点改进。首先，生测改用透明PET塑料瓶(容积50mL，瓶高69mm，直径42mm)进行，并在其瓶身一侧开6mm直径的孔，并于瓶内贴透气的医用胶带封住开孔，既能防止试虫逃逸又能为试虫的生长提供足量的空气，解决了试虫意外死亡对生测结果的影响。其次，瓶盖与瓶身可分离，可以只用瓶盖完成生测用饲料的准备。白色瓶盖，用直径30mm开孔器打孔，将双层石蜡封口膜(parafilmM，USA)拉伸4倍后罩住开孔的盖子，添加200μL人工饲料，再用拉伸的石蜡封口膜覆于人工饲料上密封，制作成饲料囊。将需替换的饲料与瓶盖一同取下，更换新的即可。整个过程可以分步骤进行，利于操作，减少试虫逃逸，极大的方便了生测实验的进行。最后，在瓶底加入2％浓度的琼脂糖凝胶，可以维持瓶内对灰飞虱适宜的湿度，只要控温良好的培养箱皆可进行灰飞虱的生测实验。每瓶放入试虫21头，每个处理重复3次。以黑布覆盖瓶身，将瓶口朝向光源，每隔两天更换饲料。生测持续6d。人工饲料采用傅强等(2000)报道的，灰飞虱全纯人工饲料配方(表1)。表中(i)浓度大于0.05mg/mL的组分直接用十万分之一天平称量；(ii)低于0.05mg/mL的组分配制10×母液；(iii)生物素，无机盐配制100×母液使用。用1mol/LNaOH溶液将饲料溶液的pH值调至6.8，容量瓶定容。最后人工饲料用一次性的Millipore微孔(0.22μm)过滤器过滤除菌，分装在2mL离心管，储存在-20℃备用。饲料配制所有试剂购自Amresco或Sigma-Aldrich。表1.生测用灰飞虱全纯人工饲料配方生测方法测试结果新的生测体系的建立在原有生测体系的基础上，经过多点改进。相关改进使得先前生测对照处理组在20％上下浮动的死亡率，降至10％以下。2、菌株B4F11分离、活性与基因组测定Bt菌株分离采集北京百望山森林公园土样时去除腐殖质，取土壤表皮至20cm深的土壤，约30g，放入自封袋。Bt菌株分离采用温度筛选法本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种杀虫蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种杀虫蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。


2.编码权利要求1所述的杀虫蛋白的基因。


3.根据权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。


4.权利要求1所述杀虫蛋白在毒杀稻飞虱害虫中的应用。


5....

【专利技术属性】
技术研发人员：张杰，曹蓓蓓，束长龙，耿丽丽，宋福平，彭琦，梁影屏，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11