一种稳定同位素制造技术

一种稳定同位素

A stable isotope

【技术实现步骤摘要】
一种稳定同位素13C标记的Cry蛋白的制备方法
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种稳定同位素13C标记的Cry蛋白的制备方法。
技术介绍
2019年全球转基因作物的种植面积到2亿公顷，转Cry基因作物是居耐除草剂转基因作物之后的第二大类转基因作物。目前Cry基因已经成为转基因植物育种中应用最广泛、最具潜力和应用前景的抗虫基因，Cry基因己被成功导入水稻、烟草、玉米和棉花等多种植物，获得一大批具良好抗虫性状的转基因植物品种和种质资源。Cry蛋白是由苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)在芽孢形成初期表达产生的原毒素(Protoxin)被蛋白酶水解生成的具有高度特异性杀虫活性的晶体蛋白(CrystallineProtein)。其中，Cry1A是一个对鳞翅目害虫有高活性的杀虫蛋白家族，目前已知的Cry1A类基因有10个模式种类，112个杀虫基因，其中Cry1Ab/1Ac应用最为广泛。转Cry1Ab/1Ac基因抗虫水稻“华恢1号”于2009年8月17日获得了农业转基因生物安全证书，2014年12月11安全证书获得续签。随着转Bt基因作物种植面积的迅速增加，其潜在的环境安全性问题引起广泛关注。转Bt基因作物的根、茎、叶中均可表达Cry蛋白，转Cry基因作物会通过根系分泌、花粉飘落和秸秆还田等方式向环境中释放Cry蛋白，然而，这些Cry蛋白的代谢转化过程尚不清楚。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种稳定同位素13C标记的Cry蛋白的制备方法，制备出由稳定同位素13C标记的Cry蛋白，其具有较强的杀虫活性，纯度达到99％，适用于采用稳定同位素质谱技术分析Cry蛋白的环境行为和生态效益，为转Cry基因植物的环境安全评价提供参考和依据。为了达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种稳定同位素13C标记的Cry蛋白的制备方法，包括以下步骤：1)合成、克隆Cry基因合成Cry基因，将其连接至克隆载体，得到重组质粒，转化至大肠杆菌进行培养，挑取菌落摇菌培养并提取重组质粒DNA，对其进行Cry基因定性PCR检测；2)制备包含质粒表达载体的工程菌对重组质粒和表达载体pET28a分别进行双酶切，连接表达载体与重组质粒的酶切回收产物，得到质粒表达载体pET28a-Cry，热激转化至大肠杆菌，挑取转化子进行液体培养，提取质粒，经双酶切鉴定连接正确后转化到感受态细胞，得到包含质粒表达载体的工程菌；3)原核表达将包含质粒表达载体的工程菌接种到以葡萄糖为唯一碳源的M9培养基中，培养菌体至OD6000.6-0.8，添加IPTG进行诱导培养，收集全菌菌液进行SDS-PAGE分析，确认蛋白表达正确；其中，作为碳源的葡萄糖中，添加了13C标记葡萄糖；4)变性、纯化及复性超声处理细胞菌液，离心，得沉淀即包涵体，再进行变性溶解，离心、收集变性液上清得到变性包涵体，用镍柱对变性包涵体进行纯化，得到变性的13C标记Cry蛋白，再进行复性，获得稳定同位素13C标记的Cry蛋白。优选地，步骤3)中，作为碳源的葡萄糖中，13C标记葡萄糖占葡萄糖总量的1-10wt％。又，步骤2)中连接表达载体与重组质粒的酶切回收产物时，表达载体酶切片段与重组质粒酶切片段的摩尔数比为1：3-5。优选地，步骤1)的PCR检测方法中，退火温度为55-58℃。又，步骤1)中所述的Cry基因为Cry1Ab基因或Cry1Ac基因。进一步，步骤2)中，双酶切时使用的内切酶为NcoI和XhoI。又进一步，步骤2)中双酶切的反应体系为：重组质粒或表达载体10μL，NcoI1-2μL，XhoI1-2μL，10×buffer2μL，无菌水补充至20μL，37℃酶切3h。优选地，步骤3)中的诱导条件为：IPTG的用量为0.2-0.4mM，诱导培养时间4-6h。又，步骤3)的M9培养基中Na2HPO4·7H2O12-13g/L，KH2PO43.0-4.0g/L，NaCl0.5-0.6g/L，NH4Cl0.6-1.0g/L，MgSO4·7H2O0.4-0.5g/L，CaCl2·6H2O0.02-0.03g/L，葡萄糖0.04-0.08g/L。又，步骤4)中，变性溶解时，利用浓度为8M的尿素变性液对得到的包涵体进行溶解，包涵体：尿素＝1：3-5，质量比。采用稳定同位素质谱技术可以示踪和定量分析Cry蛋白在土壤环境中代谢转化过程，同时有效规避土壤中原有Cry蛋白的影响，本专利技术在原核表达过程中，使用葡萄糖为唯一碳源，在作为唯一碳源的葡萄糖中，添加了13C标记的葡萄糖，其中13C标记葡萄糖占葡萄糖总量的1-10wt％，获得13C标记的Cry蛋白，若13C标记葡萄糖占比过高，得到的13C标记的Cry蛋白的δ13C值会超过稳定同位素比质谱仪测量上限，若13C标记葡萄糖占比过低，不仅配制含有13C标记葡萄糖的葡萄糖混合物难度增加，且会造成标记量少，δ13C值过低，在示踪时难以检测。本专利技术中，进行Cry基因的PCR检测时，退火温度设为55-58℃，目的基因能够进行特异性扩增，若退火温度过低，会造成PCR非特异性扩增；若退火温度过高，目的基因无法扩增。本专利技术在双酶切时，在Cry1Ab/Ac基因中引入NcoI和XhoI的酶切位点，Cry1Ab/Ac基因可以完整表达，限定两种内切酶的用量NcoI1-2μL，XhoI1-2μL，可以充分的对目的片段进行双酶切。本专利技术在进行连接酶反应时候，控制pET28a表达载体酶切片段与pUC57-Cry1Ab/Ac重组质粒的摩尔数比为1：3-5的反应比例，连接效果最好，可以形成更多的质粒表达载体pET28a-Cry。本专利技术采用尿素变性溶解Cry包涵体时，利用8M尿素的变性液溶解包涵体时，控制粗制包涵体：尿素＝1：3-5，质量比，反应效果最佳，在此控制下尿素可以重复变性溶解包涵体，低于这个比例，包涵体无法溶解，高于这个比例，尿素就会剩余，对后续的纯化不利；在变性后采用一步纯化的Ni柱纯化方法，去除了杂质蛋白后，有助于后续的透析复性试验，得到了纯度较高、总量较高的蛋白，制备的Cry蛋白量可为12.6mg/LM9培养基。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术在原核表达过程中，使用葡萄糖为唯一碳源，使Cry蛋白中含有稳定同位素13C标记，获得的13C标记Cry杀虫蛋白纯度均达到99％，检出率高，其活性未到不良影响，适于对外源Cry蛋白在土壤中的代谢进一步进行研究，为评价转Cry基因植物和释放的Cry蛋白的环境安全和生态学效应提供物质基础和技术支持。本专利技术在制备13C标记的Cry蛋白时，成功对原核表达的包涵体进行一步Ni柱纯化和复性，得到了纯度较高、总量较高的蛋白，每升培养基中获得的Cry蛋白量可达12.6mg，具有生物活性，制备的13C标记的Cry蛋白具有较强的杀虫活性，其半致死量LC50为5.44μg蛋白/g饲料。附图说明图1为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种稳定同位素

【技术特征摘要】
1.一种稳定同位素13C标记的Cry蛋白的制备方法，包括以下步骤：
1)合成、克隆Cry基因
合成Cry基因，将其连接至克隆载体，得到重组质粒，转化至大肠杆菌进行培养，挑取菌落摇菌培养并提取重组质粒DNA，对其进行Cry基因定性PCR检测；
2)制备包含质粒表达载体的工程菌
对重组质粒和表达载体pET28a分别进行双酶切，连接表达载体和重组质粒的酶切回收产物，得到质粒表达载体pET28a-Cry，热激转化至大肠杆菌，挑取转化子进行液体培养，提取质粒，经双酶切鉴定连接正确后转化到感受态细胞，得到包含质粒表达载体的工程菌；
3)原核表达
将包含质粒表达载体的工程菌接种到以葡萄糖为唯一碳源的M9培养基中，培养菌体至OD6000.6-0.8，添加IPTG进行诱导培养，收集全菌菌液进行SDS-PAGE分析，确认蛋白表达正确；其中，作为碳源的葡萄糖中，添加了13C标记葡萄糖；
4)变性、纯化及复性
超声处理细胞菌液，离心，得沉淀即包涵体，再进行变性溶解，离心、收集变性液上清得到变性包涵体，用镍柱对变性包涵体进行纯化，得到变性的13C标记Cry蛋白，再进行复性，获得稳定同位素13C标记的Cry蛋白。


2.根据权利要求1所述稳定同位素13C标记的Cry蛋白的制备方法，其特征在于，步骤3)中，作为碳源的葡萄糖中，13C标记葡萄糖占葡萄糖总量的1-10wt％。


3.根据权利要求1或2所述稳定同位素13C标记的Cry蛋白的制备方法，其特征在于，步骤2)中连接表达载体与重组质粒的酶切回收产物时，表达载体酶切片段与重组质粒酶切片段的摩尔数比为1：3-5。


4.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：李鹏，唐雪明，潘爱虎，贾军伟，武国干，孙宇，莫芹，蒋玮，刘华，白蓝，王金斌，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海;31