一种CD45基因表达检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种CD45基因表达检测试剂盒，其包括捕获探针以及信号放大系统，所述信号放大系统包括预扩增探针、扩增探针和标记探针；所述捕获探针从5’端到3’端的组成依次为：茎部结构序列、能与CD45基因mRNA结合的特异性P1序列、间隔臂序列、P2序列；所述预扩增探针从5’端到3’端的组成依次为：能与P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述扩增探针从5’端到3’端的组成依次为：能与P4序列互补配对的P5序列、间隔臂序列、P6序列；所述标记探针具有与P6序列互补配对的P7序列，且末端修饰有荧光基团。所述试剂盒还包含快速杂交缓冲液。上述试剂盒具有灵敏度高、准确率高、检测时间短的优点，可快速准确地检测出生物样本中CD45基因的表达水平。

【技术实现步骤摘要】
一种CD45基因表达检测试剂盒
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种CD45基因表达检测试剂盒。
技术介绍
CD45，即白细胞共同抗原，是一种广泛表达在造血细胞(血小板和成熟红细胞除外)表面的跨膜蛋白酪氨酸磷酸酯酶(PTPase)。CD45由定位于染色体1q31.3-1q32.1的PTPRC基因编码，是调节T细胞和B细胞活化成熟和胸腺选择的重要因子，在淋巴细胞发育和活化、细胞因子受体介导的信号转导、骨髓细胞功能中起着重要作用。随着对CD45分子基因结构和功能的不断研究和深入认识，CD45已作为重要的分子靶点，用于免疫治疗和抗癌策略研究。在循环肿瘤细胞(CTCs)的研究中，CD45常被作为白细胞标志物，用于CTCs的分离与鉴定。研究发现，联合CD45的荧光原位杂交(FISH)法可显著改善癌症患者血液样本中CTCs检测的敏感性和特异性，该方法检出的CTCs数量与癌症患者的疾病状态、预后有关。另有研究也发现，EpCAM+CK+CD45－循环物质数量与去势抵抗性前列腺癌患者的总生存率有关，而EpCAM+CK+CD45+循环物质数量与患者总生存率无关。鉴于CD45表达与肿瘤临床特点和预后的相关性及其在CTCs研究中的应用价值，促使我们开发一种CD45基因表达检测试剂盒，该试剂盒将有助于进一步深入研究CD45基因的表达在各种肿瘤发生、发展及预后方面的临床意义。目前CD45表达检测多采用流式细胞术和原位杂交法。流式细胞术是在细胞分子水平上通过CD45单克隆抗体对单细胞悬液进行多参数、快速的定量分析，从而实现CD45表达的检测，但其检测结果的准确性受多方因素影响，且该方法涉及的仪器成本高，需要训练有素的人员来操作系统和制样。原位杂交法是将标记的CD45基因探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，从而实现对CD45基因表达的检测。该方法常应用于CTCs研究中，可检测单个细胞中CD45基因的定位和表达情况；但是，该方法的检测结果受多方面影响，如样本前处理方法、探针灵敏度和特异性、杂交液等；另外，原位杂交法步骤繁多，容易造成荧光信号丢失，可能导致假阴性结果。针对现有检测技术的不足，中国专利申请CN201710217573.3公开了一种基因表达检测试剂盒，所述试剂盒在用于基因原位杂交检测时具有特异性高和灵敏度好的优点。但进一步的研究发现，上述检测试剂盒的信号放大系统和检测时长需要进一步优化，以达到更好的检测效果。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的在于提供一种准确率高、检测时间短的CD45基因表达检测试剂盒，可快速地、准确地检测出生物样本中CD45基因的表达水平，提供临床相关辅助信息。具体技术方案如下：一种CD45基因表达检测试剂盒，包括针对CD45基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括预扩增探针、扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针；其中，所述捕获探针为茎环状，用于连接CD45基因mRNA和预扩增探针，每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：茎部结构序列、能与CD45基因mRNA结合的特异性P1序列、间隔臂序列、P2序列；所述茎部结构序列可与P2序列3’端的碱基互补形成茎环结构；所述P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1和CD45基因mRNA之间不存在特异性结合的序列；所述预扩增探针连接捕获探针与扩增探针，每条预扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与茎环状捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P3序列的长度为24～28bp，GC含量为25％～45％；所述P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3和CD45基因mRNA之间不存在特异性结合的序列，所述P4序列的长度为24～28bp，GC含量为25％～45％；所述扩增探针连接预扩增探针与标记探针，每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与预扩增探针的P4序列互补配对的P5序列、间隔臂序列、P6序列；所述P6序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3、P4和CD45基因mRNA之间不存在特异性结合的序列；所述标记探针连接扩增探针与荧光基团，每条标记探针具有与相应扩增探针P6序列互补配对的P7序列，且末端修饰有荧光基团。在其中一些实施例中，优选所述P3序列的长度为24～26bp，GC含量为25％～30％。在其中一些实施例中，优选所述P4序列的长度为24～26bp，GC含量为25％～30％。在其中一些实施例中，针对CD45基因mRNA的捕获探针中，特异性P1序列选自SEQIDNO.1～SEQIDNO.10中的5条或5条以上，茎部结构序列为SEQIDNO.21，P2序列为SEQIDNO.23；和/或，针对CD45基因mRNA的预扩增探针中，P3序列为SEQIDNO.25，P4序列为SEQIDNO.27；和/或，针对CD45基因mRNA的扩增探针中，P5序列为SEQIDNO.29，P6序列为SEQIDNO.31；和/或，针对CD45基因mRNA的标记探针中，P7序列为SEQIDNO.33。在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括有针对内参基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括预扩增探针、扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针；其中，所述捕获探针为茎环状，用于连接内参基因mRNA和预扩增探针，每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：茎部结构序列、能与内参基因mRNA结合的特异性P1序列、间隔臂序列、P2序列；所述茎部结构序列可与P2序列3’端的碱基互补形成茎环结构；所述P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1和内参基因mRNA之间不存在特异性结合的序列；所述预扩增探针连接捕获探针与扩增探针，每条预扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与茎环状捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P3序列的长度为24～28bp，GC含量为25％～45％；所述P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3和内参基因mRNA之间不存在特异性结合的序列，所述P4序列的长度为24～28bp，GC含量为25％～45％；所述扩增探针连接预扩增探针与标记探针，每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与预扩增探针的P4序列互补配对的P5序列、间隔臂序列、P6序列；所述P6序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3、P4和内参基因mRNA之间不存在特异性结合的序列；所述标记探针连接扩增探针与荧光基团，每条标记探针具有与相应扩增探针P6序列互补配对的P7序列，且末端修饰有与荧光基团，所述荧光基团与针对CD45基因mRNA的标记探针的荧光基团互不相同。在其中一些实施例中，优选所述内参基因为ACTB基因。在其中一些实施例中，所述针对A本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CD45基因表达检测试剂盒，其特征在于，包括针对CD45基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括预扩增探针、扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针；其中，/n所述捕获探针为茎环状，用于连接CD45基因mRNA和预扩增探针，每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：茎部结构序列、能与CD45基因mRNA结合的特异性P1序列、间隔臂序列、P2序列；所述茎部结构序列可与P2序列3’端的碱基互补形成茎环结构；所述P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1和CD45基因mRNA之间不存在特异性结合的序列；/n所述预扩增探针连接捕获探针与扩增探针，每条预扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与茎环状捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P3序列的长度为24～28bp，GC含量为25％～45％；所述P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3和CD45基因mRNA之间不存在特异性结合的序列，所述P4序列的长度为24～28bp，GC含量为25％～45％；/n所述扩增探针连接预扩增探针与标记探针，每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与预扩增探针的P4序列互补配对的P5序列、间隔臂序列、P6序列；所述P6序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3、P4和CD45基因mRNA之间不存在特异性结合的序列；/n所述标记探针连接扩增探针与荧光基团，每条标记探针具有与相应扩增探针P6序列互补配对的P7序列，且末端修饰有荧光基团。/n...

【技术特征摘要】
1.一种CD45基因表达检测试剂盒，其特征在于，包括针对CD45基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括预扩增探针、扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针；其中，
所述捕获探针为茎环状，用于连接CD45基因mRNA和预扩增探针，每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：茎部结构序列、能与CD45基因mRNA结合的特异性P1序列、间隔臂序列、P2序列；所述茎部结构序列可与P2序列3’端的碱基互补形成茎环结构；所述P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1和CD45基因mRNA之间不存在特异性结合的序列；
所述预扩增探针连接捕获探针与扩增探针，每条预扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与茎环状捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P3序列的长度为24～28bp，GC含量为25％～45％；所述P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3和CD45基因mRNA之间不存在特异性结合的序列，所述P4序列的长度为24～28bp，GC含量为25％～45％；
所述扩增探针连接预扩增探针与标记探针，每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与预扩增探针的P4序列互补配对的P5序列、间隔臂序列、P6序列；所述P6序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3、P4和CD45基因mRNA之间不存在特异性结合的序列；
所述标记探针连接扩增探针与荧光基团，每条标记探针具有与相应扩增探针P6序列互补配对的P7序列，且末端修饰有荧光基团。


2.根据权利要求1所述的CD45基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述P3序列的长度为24～26bp，GC含量为25％～30％；和/或，所述P4序列的长度为24～26bp，GC含量为25％～30％。


3.根据权利要求1或2所述的CD45基因表达检测试剂盒，其特征在于，针对CD45基因mRNA的捕获探针中，特异性P1序列选自SEQIDNO.1～SEQIDNO.10中的5条或5条以上，茎部结构序列为SEQIDNO.21，P2序列为SEQIDNO.23；
和/或，针对CD45基因mRNA的预扩增探针中，P3序列为SEQIDNO.25，P4序列为SEQIDNO.27；
和/或，针对CD45基因mRNA的扩增探针中，P5序列为SEQIDNO.29，P6序列为SEQIDNO.31；
和/或，针对CD45基因mRNA的标记探针中，P7序列为SEQIDNO.33。


4.根据权利要求1所述的CD45基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括有针对内参基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括预扩增探针、扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针；其中，
所述捕获探针为茎环状，用于连接内参基因mRNA和预扩增探针，每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：茎部结构序列、能与内参基因mRNA结合的特异性P1序列、间隔臂序列、P2序列；所述茎部结构序列可与P2序列3’端的碱基互补形成茎环结构；所述P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1和内参基因mRNA之间不存在特...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴诗扬，许嘉森，黄洁芬，刘志明，刘芳，
申请(专利权)人：益善生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44