高效定量检测细胞外囊泡中PD-L1水平的方法、ELISA试剂盒及使用方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学和生物技术领域，具体涉及一种高效定量检测细胞外囊泡中PD‑L1水平的方法、ELISA试剂盒及使用方法，利用抗CD63抗体、CD9抗体或CD81抗体特异性捕获细胞外囊泡，利用抗PD‑L1抗体检测细胞外囊泡中PD‑L1蛋白水平，利用所构建的对应的CD63‑PD‑L1、CD9‑PD‑L1或CD81‑PD‑L1融合蛋白作为标准品实现对细胞外囊泡中PD‑L1的定量检测。本发明专利技术实现了对细胞外囊泡这一复杂结构PD‑L1水平的定量检测；同时，通过自主构建的CD63‑PD‑L1、CD9‑PD‑L1、CD81‑PD‑L1融合蛋白作为标准蛋白，使检测结果以具体的蛋白浓度进行表征。

【技术实现步骤摘要】
高效定量检测细胞外囊泡中PD-L1水平的方法、ELISA试剂盒及使用方法
本专利技术涉及分子生物学和生物
，具体涉及一种高效定量检测细胞外囊泡中PD-L1水平的方法、ELISA试剂盒及使用方法。
技术介绍
我国每年新增恶性肿瘤患者430万人，死亡280万人，肿瘤已经成为我国死亡的最主要原因，是我国最主要的公共卫生问题之一。更让人深忧的是，恶性肿瘤患者的预后并未随着手术和放化疗技术的提高而得到明显改善。近来年快速兴起并斩获2018年诺贝尔奖的免疫疗法为恶性肿瘤患者带来了新的希望。其中针对免疫检查点程序性凋亡配体-1/程序性死亡受体-1(PD-L1/PD-1)的抑制剂是目前肿瘤免疫治疗的代表性药物，已经证实对多种恶性肿瘤具有明显疗效。然而，仅有不到30％的患者能够从PD-L1/PD-1免疫治疗中获益。而免疫治疗无效的患者不仅要承受高昂的治疗费用和免疫治疗副反应，还有可能因此错过接受其他治疗的时机。因此，当前迫切需要一种寻找能够精准预测免疫治疗疗效的生物标志物。细胞外囊泡(Extracellularvesicles,Evs)是由细胞分泌的直径介于50-1000nm的脂质双分子层颗粒，其携带多种来源于母细胞的特征性生物信息分子，如蛋白质、核酸、脂类，甚至细胞器。近年来，体液中的细胞外囊泡作为液体活检的重要分支获得了广泛的关注。本项目组近期研究发现肿瘤细胞可分泌PD-L1+的细胞外囊泡进入外周血，且肿瘤患者外周血中PD-L1+的细胞外囊泡水平及其在免疫治疗早期的变化趋势和幅度能够有效预测该患者对治疗的反应性。基于以上结果，我们前期提出了一种基于肿瘤患者外周血细胞外囊泡上PD-L1水平ELISA检测策略。该ELISA策略，以抗PD-L1抗体作为捕获抗体，将细胞外囊泡固定于ELISA孔板中，利用抗PD-L1抗体来检测细胞外囊泡上的PD-L1水平，利用PD-L1标准蛋白对细胞外囊泡PD-L1水平进行定量。然而，患者体液中既存在细胞外囊泡上的PD-L1，还存在大量游离的PD-L1蛋白。显然，直接对体液样本进行PD-L1水平ELISA检测，将受到游离PD-L1蛋白的干扰。因此，为了避免游离PD-L1的干扰，该策略需要预先利用超速离心法对体液中的细胞外囊泡进行分离和纯化。然而，超速离心法不仅耗时费力，缺乏标准化的操作流程，并且需要大型的超速离心设备，不利于临床推广应用；更重要的是，超速离心法分离细胞外囊泡的效率不足30％。这30％的细胞外囊泡中PD-L1的水平能否准确反映总细胞外囊泡中PD-L1水平目前仍然不清楚。因此亟需发展一种可靠、快速并且经济的、可以直接高效定量检测体液中细胞外囊泡上PD-L1水平的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种高效定量检测细胞外囊泡中PD-L1水平的方法，避免了细胞外囊泡离心纯化这一步骤繁琐、样本回收率低的缺陷，同时还避免了游离PD-L1蛋白对检测结果的干扰，可实现特异性识别并定量检测细胞外囊泡中PD-L1的蛋白水平。本专利技术的目的之二在于提供一种高效定量检测细胞外囊泡中PD-L1水平的ELISA试剂盒，可以快速定量检测细胞外囊泡中PD-L1水平。本专利技术的目的之三在于提供一种高效定量检测细胞外囊泡中PD-L1水平的ELISA试剂盒的使用方法。本专利技术实现目的之一所采用的方案是：一种高效定量检测细胞外囊泡中PD-L1水平的方法，利用抗CD63抗体、抗CD9抗体或抗CD81抗体的特异性捕获细胞外囊泡，利用抗PD-L1抗体检测细胞外囊泡中PD-L1蛋白水平，利用构建的对应的CD63-PD-L1融合蛋白、CD9-PD-L1融合蛋白或CD81-PD-L1融合蛋白作为标准品实现对细胞外囊泡中PD-L1的定量检测。优选地，所述CD63-PD-L1融合蛋白的核酸序列如SEQIDNo：1所示，CD9-PD-L1融合蛋白的核酸序列如SEQIDNo：2所示，CD81-PD-L1融合蛋白的核酸序列如SEQIDNo：3所示。优选地，所述细胞外囊泡来源于血液、唾液、尿液、脑脊液、腹腔积液、胸腔积液、汗液、精液、淋巴液、细胞培养上清中的任意一种。除血液为针对全身各型癌症外，所采集的其余体液为针对所检测癌症的特异性部位液体，如针对口腔及邻近部位癌症的唾液、针对尿路上皮癌的尿液、针对肺癌的胸腔积液、针对脑胶质瘤的脑脊液等。本专利技术实现目的之二所采用的方案是：一种高效定量检测细胞外囊泡中PD-L1水平的ELISA试剂盒，包括ELISA酶标板、封板膜、标准蛋白、标准蛋白稀释液、样品稀释液、浓缩洗涤液、酶标抗体A、酶标抗体B、显色剂A液、显色剂B液和终止液；其中，所述ELISA酶标板为按1-5μg/mL浓度提前包被好抗CD63抗体、抗CD9抗体或抗CD81抗体的酶标板；所述标准蛋白对应为构建的CD63-PD-L1、CD9-PD-L1或CD81-PD-L1融合蛋白。ELISA酶标板为Biolegend公司的Nunc型号酶标板；封板膜为Corning公司的封板膜，货号UC-500，所述标准蛋白稀释液包括缓冲液100-300mmol/L、稳定剂5-20g/L、防腐剂2-6g/L。优选地，所述抗CD63抗体为ThermoFisher公司的抗CD63抗体，货号TJ26539346；所述抗CD9抗体为ThermoFisher公司的抗CD9抗体，货号TL2686763；所述抗CD81抗体为Novus公司的抗CD81抗体，货号531413。优选地，所述CD63-PD-L1融合蛋白的核酸序列如SEQIDNo：1所示，CD9-PD-L1融合蛋白的核酸序列如SEQIDNo：2所示，CD81-PD-L1融合蛋白的核酸序列如SEQIDNo：3所示。优选地，所述浓缩洗涤液为含0.01-0.05mol/LPBS、质量百分数1‰-5‰的Tween-20的水溶液；所述酶标抗体A为1μg/mLPD-L1检测抗体，所述酶标抗体B为1μg/mL辣根过氧化物酶耦联显色抗体。本试剂盒提供的酶标抗体A为1μg/mLPD-L1检测抗体，为对市售多种PD-L1检测抗体筛选后，选择eBioscience公司的PD-L1抗体，货号13-5983-82。本试剂盒提供的酶标抗体B为1μg/mL辣根过氧化物酶耦联显色抗体，为对市售多种HRP显色抗体筛选后，选择BD公司的HRP显色抗体，货号554066。优选地，所述显色剂A液按质量百分比计包括醋酸钠2.72％、柠檬酸0.32％、双氧水0.02％，配置于蒸馏水中；所述显色剂B液按质量百分比计包括乙二胺四乙酸二钠0.04％、柠檬酸0.19％、甘油9％、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺0.03％，配置于蒸馏水中；所述终止液为2mol/L稀硫酸。本专利技术实现目的之三所采用的方案是：一种所述的高效定量检测细胞外囊泡中PD-L1水平的ELISA试剂盒的使用方法，包括以下步骤：(1)在室温条件下平衡后，取出ELISA酶标板，在酶标板上设置标准品孔和样本孔，标准品孔加入不同浓度梯度的标准蛋白，样本孔中加入待测体液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效定量检测细胞外囊泡中PD-L1水平的方法，其特征在于：利用抗CD63抗体、抗CD9抗体或抗CD81抗体的特异性捕获细胞外囊泡，利用抗PD-L1抗体检测细胞外囊泡中PD-L1蛋白水平，利用构建的对应的CD63-PD-L1融合蛋白、CD9-PD-L1融合蛋白或CD81-PD-L1融合蛋白作为标准品实现对细胞外囊泡中PD-L1的定量检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种高效定量检测细胞外囊泡中PD-L1水平的方法，其特征在于：利用抗CD63抗体、抗CD9抗体或抗CD81抗体的特异性捕获细胞外囊泡，利用抗PD-L1抗体检测细胞外囊泡中PD-L1蛋白水平，利用构建的对应的CD63-PD-L1融合蛋白、CD9-PD-L1融合蛋白或CD81-PD-L1融合蛋白作为标准品实现对细胞外囊泡中PD-L1的定量检测。


2.根据权利要求1所述的高效定量检测细胞外囊泡中PD-L1水平的方法，其特征在于：所述CD63-PD-L1融合蛋白的核酸序列如SEQIDNo：1所示，CD9-PD-L1融合蛋白的核酸序列如SEQIDNo：2所示，CD81-PD-L1融合蛋白的核酸序列如SEQIDNo：3所示。


3.根据权利要求1所述的高效定量检测细胞外囊泡中PD-L1水平的方法，其特征在于：所述细胞外囊泡来源于血液、唾液、尿液、脑脊液、腹腔积液、胸腔积液、汗液、精液、淋巴液、细胞培养上清中的任意一种。


4.一种高效定量检测细胞外囊泡中PD-L1水平的ELISA试剂盒，其特征在于：包括ELISA酶标板、封板膜、标准蛋白、标准蛋白稀释液、样品稀释液、浓缩洗涤液、酶标抗体A、酶标抗体B、显色剂A液、显色剂B液和终止液；
其中，所述ELISA酶标板为按1-5μg/mL浓度提前包被好抗CD63抗体、抗CD9抗体或抗CD81抗体的酶标板；
所述标准蛋白对应为构建的CD63-PD-L1、CD9-PD-L1或CD81-PD-L1融合蛋白。


5.根据权利要求4所述的高效定量检测细胞外囊泡中PD-L1水平的ELISA试剂盒，其特征在于：所述抗CD63抗体为ThermoFisher公司的抗CD63抗体，货号TJ26539346；所述抗CD9抗体为ThermoFisher公司的抗CD9抗体，货号TL2686763；所述抗CD81抗体为Novus公司的抗CD81抗体，货号531413。


6.根据权利要求4所述的高效定量检测细胞外囊泡中PD-L1水平的ELISA试剂盒，其特征在于：所述CD63-PD-L1融合蛋白的核酸序列如SEQIDNo：1所示，CD9-PD-L1融合蛋白的核酸序列如SEQIDNo：2所示，CD81-PD-L1融合蛋白的核酸序列如SEQIDNo：3所示。

【专利技术属性】
技术研发人员：陈刚，刘金元，余自力，吴敏，赵怡芳，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42