一种检测多氯联苯的生物传感器及其制备方法技术

本发明专利技术涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于金纳米粒子的DNA分子机器检测多氯联苯（PCB）的生物传感器，发卡探针HAP1通过polyA修饰到纳米金的表面和HAP2、拱形探针（由Walker链和APT杂交成的双链）通过polyA修饰到纳米金的表面；基于目标物PCB对适配体的亲和力，破坏拱形探针，释放Walker核酸链，通过toehold介导打开HAP1，进而打开HAP2，从而把Walker链挤掉，挤掉的Walker链与其他的HAP1杂交，依次循环直至HAP2全部被打开，暴露出G‑rich序列，在存在血红素时形成G‑四联体/血红素DNA酶。G‑四联体/血红素类辣根过氧化物酶催化鲁米诺产生化学发光，从而构建了生物传感器；该传感器反应只需一步，检测速度快，操作简便，价格低廉，检测限低，特异性高。

【技术实现步骤摘要】
一种检测多氯联苯的生物传感器及其制备方法
本专利技术涉及传感器
，特别涉及基于金纳米粒子的DNA分子机器检测多氯联苯的生物传感器，还涉及其制备方法。
技术介绍
多氯联苯(PCBs)是一类广泛的合成有机化合物，被广泛用作杀虫剂和电器元件的流体绝缘体。多氯联苯由于其持久性和化学稳定性高，不易分解，可以通过食物链在人体组织中富集。多氯联苯即使在超微量水平也会严重危害人体健康和生命。因此，开发快速、低成本、高灵敏度和选择性的检测多氯联苯的分析方法是十分必要的。
技术实现思路
为了实现更加灵敏的、特异性的检测多氯联苯，本申请提出了一种基于催化发夹自组装的DNA分子机器检测多氯联苯的生物传感器。一种检测多氯联苯的生物传感器，包括纳米金溶液、发卡探针HAP1和HAP2、Walker、APT、血红素、钾离子（K+）、目标物和缓冲液；所述的序列为：HAP1碱基序列如SEQNo.1所示；具体为:5’-AAAAAATTTTTTTTTTTTATTCTCCTTAAACATCCGTCGGAGAATGGGTAGGGCCGACGGATGTTTAAG-3’；HAP2碱基序列如SEQNo.2所示；具体为:5’-ATCCGTCGGCCCTACCCATTCTCCGACGGATGTTTAAGGAGAATGGGTAGGGCGGGTTGGG-3’；Walker碱基序列如SEQNo.3所示；具体为:5’-AAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGACGGATGTTTAAGGAGAATGG-3’；APT碱基序列如SEQNo.4所示；具体为:5’-CACTCGGACCCCATTCTCCTTCCATCCCTCATCCGTCCAC-3’；所述的目标物为多氯联苯。上述生物传感器的制备方法，包括以下步骤：（1）制备纳米金溶液；（2）拱形探针的构建；（3）将拱形探针和发卡探针HAP1修饰到金纳米粒子表面，得到功能化的纳米金溶液；（4）均相反应：将多氯联苯、发卡探针HAP2、血红素、钾离子（K+）和功能化的纳米金溶液加入到均相中，混和均匀后孵育；（5）荧光仪检测化学发光。所述的步骤（1）中纳米金溶液的浓度为1nM。所述的步骤（2）拱形探针的构建步骤如下：将灭菌水、5×PBS、Walker和APT加入到预先准备好的灭菌的EP管中，震荡30s，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温杂交为拱形探针，储存于-20℃备用。所述的步骤（3）拱形探针和HAP1修饰到金纳米粒子表面的操作步骤如下：①将拱形探针和HAP1混合，得到混合溶液Q；②以3μL/min的速度混合溶液Q加入到纳米金溶液中，搅拌均匀，4℃放置；③以2μL/min的速度将PB缓冲液加入到纳米金溶液中，搅拌均匀，10分钟后，以2μL/min的速度将27μLPBS缓冲液加入到纳米金溶液中，4℃放置；④以2μL/min的速度将PBS缓冲液加入到纳米金溶液中，搅拌均匀，4℃放置；⑤加入灭菌水洗脱未标记上的DNA链，4℃保存备用。所述的步骤（4）均相反应操作步骤如下：将发卡探针HAP2、血红素、缓冲液、功能化的纳米金溶液和多氯联苯加入离心管中，震荡30s，于37℃下水浴60min。所述的步骤（5）荧光仪设置激发波长为350nm，发射波长设置为420nm，检测范围设置350nm-550nm。该专利技术的检测方式是化学发光法检测，基于目标物PCB对适配体特殊的亲和力，使得拱形探针被破坏，释放Walker核酸链，释放的Walker核酸链可以通过toehold介导打开HAP1，打开的HAP1又可以打开HAP2从而把Walker核酸链挤掉，挤掉的Walker链又可以与纳米金表面的其它HAP1杂交，依次循环直到所有的HAP2全部被打开，而打开的HAP2暴露出其G-rich序列，在存在血红素时形成G-四联体/血红素DNA酶，富集在纳米金颗粒周围。运用G-四联体/血红素类辣根过氧化物酶的催化性能催化鲁米诺产生化学发光。本专利技术基于核酸适配体与目标物之间的特异性识别能力，DNA分子机器的特殊结构和催化发夹自组装实现目标循环放大，利用纳米金离子作为载体，实现对目标物灵敏检测的生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，灵敏度高等优点，可以弥补PCB现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。本专利技术的有益效果：1、利用了多氯联苯与核酸适配体的特异型识别的特性进行检测；2、利用了DNAWalker和催化发夹自组装，起到了信号放大的作用，提高了检测的灵敏度；3、该传感器的反应条件温和，反应速度快；4、检测原理的主要过程均是在均相溶液中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；5、制备方法简单，性能稳定，适用于食品、土壤及饮用水中PCB的检测；6、制备过程的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。附图说明图1为该实验的原理图；图2为实施例1检测结果图；图3为实施例2检测结果图；图4为实施例3检测结果图；图5为实施例4传感器检测PCB的工作曲线。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步说明。实施例1拱形探针的构建步骤如下：将灭菌水、5×PBS、Walker和APT加入到预先准备好的灭菌的EP管中，震荡30s，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温杂交为拱形探针，储存于-20℃备用。拱形探针和HAP1修饰到金纳米粒子表面的操作步骤如下：①将拱形探针和HAP1按照1:20的比例混合，得到混合溶液Q；②以3μL/min的速度将150µL混合溶液Q加入到纳米金溶液中，搅拌均匀，4℃放置24h；③以2μL/min的速度将50μLPB缓冲液加入到纳米金溶液中，搅拌均匀，10分钟后，以2μL/min的速度将27μLPBS缓冲液加入到纳米金溶液中，4℃放置48h；④以2μL/min的速度将62μLPBS缓冲液加入到纳米金溶液中，搅拌均匀，4℃放置；⑤加入灭菌水洗脱未标记上的DNA链，4℃保存备用。均相溶液中反应过程的主要步骤如下：将灭菌水、5×缓冲液（3µL）、功能化的纳米金溶液（5µL）、目标物（3µL）、HAP2（3µL）、K+（3µL）、血红素（3µL）（浓度分别为0.2µM，0.4µM，0.6µM，0.8µM，1.0µM，1.2µM）、鲁米诺（3µL）、过氧化氢（3.33µL）加入到预先准备好的灭菌的EP管中并震荡，放入37℃的恒温水浴锅孵育1h.荧光仪检测化学发光主要步骤如下：将均相反应后的溶液（30µL）稀释至100µL，用荧光仪在420nm处检测化学发光。荧光仪激发波长设置为350nm，发射波长本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测多氯联苯的生物传感器，其特征在于，包括纳米金溶液、发卡探针HAP1和HAP2、Walker、APT、血红素、钾离子、目标物和缓冲液；/n所述的序列为：/nHAP1碱基序列如SEQ No.1所示；具体为:5’-AAAAAATTTTTTTTTTTT

【技术特征摘要】
1.一种检测多氯联苯的生物传感器，其特征在于，包括纳米金溶液、发卡探针HAP1和HAP2、Walker、APT、血红素、钾离子、目标物和缓冲液；
所述的序列为：
HAP1碱基序列如SEQNo.1所示；具体为:5’-AAAAAATTTTTTTTTTTTATTCTCCTTAAACATCCGTCGGAGAATGGGTAGGGCCGACGGATGTTTAAG-3’；
HAP2碱基序列如SEQNo.2所示；具体为:5’-ATCCGTCGGCCCTACCCATTCTCCGACGGATGTTTAAGGAGAATGGGTAGGGCGGGTTGGG-3’；
Walker碱基序列如SEQNo.3所示；具体为:5’-AAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGACGGATGTTTAAGGAGAATGG-3’；
APT碱基序列如SEQNo.4所示；具体为:5’-CACTCGGACCCCATTCTCCTTCCATCCCTCATCCGTCCAC-3’；
所述的目标物为多氯联苯。


2.权利要求1所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备纳米金溶液；
（2）拱形探针的构建；
（3）将拱形探针和发卡探针HAP1修饰到金纳米粒子表面，得到功能化的纳米金溶液；
（4）均相反应：将多氯联苯、发卡探针HAP2、血红素、钾离子和功能化的纳米金溶液加入到均相中，混和均匀后孵育；
（5）荧光仪检测化学发光。


3.根据权利要求2所述的制备方...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘素，张曼茹，王玉，黄加栋，王敬锋，张儒峰，赵一菡，瞿晓南，孙文玉，王业茹，江龙，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东;37