一种人葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条制造技术

本发明专利技术提供一种人葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条，具有依次排列的样品垫、金标垫、NC膜和吸水垫，其中，由保藏号为CGMCC No.18841的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体4F4作为金标抗体偶联胶体金，并同时将单克隆抗体4F4作为检测抗体，金标抗体偶联胶体金后喷涂于金标垫上，检测抗体喷涂于NC膜上形成检测线。另外，本发明专利技术还提供了人葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条在快速检测人葡萄球菌中的应用。本发明专利技术的测试纸条灵敏度和稳定性均较好，并且可以专一检测人葡萄球菌凝固酶阴性菌，特异性较好。

【技术实现步骤摘要】
一种人葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种人葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条。
技术介绍
人葡萄球菌(Staphylococcushominis)属于葡萄球菌属，不会产生凝固酶、杀白细胞素等，属于凝固酶阴性葡萄球菌(coagulasenegativestaphylococci，CoNS)致病力弱，通常被认为是条件致病菌。随着人工关节、静脉导管、支架等医学侵入操作大量应用，据研究显示，葡萄球菌引起的血流感染中超过4/5是由CoNS引起，约1/5是由人葡萄球菌造成，其引起的感染慢性反复临床治疗十分困难。然而目前，对临床离人葡萄球菌的致病性缺乏相关的报道与研究。
技术实现思路
本专利技术是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种人葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条。本专利技术提供了一种人葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条，具有这样的特征，包括：另外，本专利技术还提供了人葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条在快速检测人葡萄球菌中的应用。专利技术的作用与效果根据本专利技术所涉及的人葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条，由于采用了新筛选的配对单克隆抗体分别喷涂金标垫和检测线，实验结果对凝固酶阴性人葡萄球菌的检测特异性和灵敏性均较高。附图说明图1是本专利技术实施例中人葡萄球菌的免疫胶体金检测试纸条的单抗SDS-PAGE电泳图；图2是本专利技术实施例中人葡萄球菌的免疫胶体金检测试纸条的各抗体偶联胶体金pH结果；图3是本专利技术实施例中人葡萄球菌的免疫胶体金检测试纸条的各抗体偶联胶体金结合量结果；图4是本专利技术实施例中人葡萄球菌的免疫胶体金检测试纸条的结构示意图；图5(a)是本专利技术实施例中人葡萄球菌的免疫胶体金检测试纸条的胶体金试纸条灵敏度结果；图5(b)是本专利技术实施例中人葡萄球菌的免疫胶体金检测试纸条的胶体金试纸条检测8种人葡萄球菌及交叉反应结果。具体实施方式为了使本专利技术实现的技术手段与功效易于明白了解，以下结合实施例及附图对本专利技术作具体阐述。本专利技术的一种人葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条，具有依次排列的样品垫14、金标垫13、NC膜12和吸水垫11，由保藏号为CGMCCNo.18841的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体4F4作为金标抗体偶联胶体金，并同时将单克隆抗体4F4作为检测抗体，金标抗体偶联胶体金后喷涂于金标垫13上，检测抗体喷涂于NC膜12上形成检测线。另外，本专利技术还提供了人葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条在快速检测人葡萄球菌中的应用。本专利技术的实施例中所使用的菌株、试剂与仪器如下所示：实验菌株：本实验中所用菌株为凝固酶阴性人葡萄球菌(Staphylococcushominis)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC27660、ATCC6538、ATCC29213、ATCC25923，表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)CMCC260691。主要试剂：上海金标生物科技有限公司；硝酸纤维素膜(NC膜)135SMillipore；羊抗鼠、HRP-羊抗鼠、羊抗兔生工生物工程股份有限公司。主要仪器：酶标仪SpectraMaxM2购自MolecularDevices；Nanodrop2000C购自ThermoScientific；点样仪AD6010购自BIO-DOT；扫描仪PhantomV9购自MICROTEK；恒温培养摇床SPH-100B购自上海世平；蛋白纯化仪BioLogicTMLP358BR5057购自BIO-RAD；单人净化工作台SW-SJ-2D型购自苏州净化。实施例一：人葡萄球菌单克隆抗体制备筛选出3株稳定分泌抗人葡萄球菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为4F4、7G3、11C4，分别进行亚类及亚型鉴定、测定浓度、效价、纯度，并对制备的单克隆抗体进行特异性验证。1.单克隆抗体的亚型鉴定通过单克隆抗体亚型鉴定试剂盒测定各抗体亚类、亚型，由间接ELISA测定结果可得，亚类均为IgG2a。2.单克隆抗体的纯化、纯度及效价检测腹水先用饱和硫酸铵粗提后，再用ProteinGSepharose亲和层析法纯化，将制备纯化所得抗体4F4通过Nanodrop2000C测定仪测得浓度如表1，4F4浓度为2.4mg/mL。用SDS-PAGE分析纯度，5％积层胶，10％分离胶，120V电压，电泳至胶底部，凝胶用考马斯亮蓝法染色，脱色液脱色。图1是本专利技术实施例中人葡萄球菌的免疫胶体金检测试纸条的单抗SDS-PAGE电泳图，对腹水和纯化后抗体纯度进行分析。由图1可知，腹水纯化前杂条带较多，而纯化后抗体在约50kD出现1条重链，约25kD出现1条轻链。纯化后没有杂条带，抗体纯度高，纯化效果好。采用这种方法纯化后抗体用于后续实验可见。腹水纯化后单克隆抗体效价测定的步骤如下：步骤1，将108CFU/mL细菌抗原在对应的孔中加入100μL，37℃2h。步骤2，倒空液体并拍干残留液体，用230μLPBST洗液清洗3次。步骤3，每个孔中加220μL3％BSA，37℃封闭1h。步骤4，倒空液体并拍干残留液体，用230μL洗液清洗3次。步骤5，每个孔中加100μL抗体(2mg/mL稀释1000倍)，37℃孵育1h。步骤6，倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加230μL洗液洗涤3次。步骤7，每个孔中100μL的HRP标记的二抗(sigma)，室温孵育1h。步骤8，倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加230μL洗液洗涤3次。步骤9，每个孔中加100μL底物，显色15min，加终止液100μL并立即在OD450nm读数。经测定腹水抗体效价达128000，纯化后抗体效价达8000，阴性对照(N值)为0.062。3.单克隆抗体特异性测定采用间接ELISA法分析4F4单克隆抗体的特异性，结果见表1。表1单克隆抗体的特异性注：“+”为能结合，“-”为不结合产生经过上述鉴定的人葡萄球菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株4F4于2019年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.18841。实施例二：胶体金试纸条抗体最优组合的确定由于不同的抗体组合对胶体金试纸条检测灵敏度及品质优劣影响较大，因此，需对制备胶体金试纸条过程中所用抗体进行配对择优选择，步骤如下：1.各抗体偶联胶体金的最佳pH的确定分别取100μL胶体金溶液于96孔板8个孔中，加入0.2mol/L碳酸钾调整溶液pH，加入量分别为0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1uL，每孔加入5μL浓度为2mg/mL的单克隆抗体。反应10min，各孔加入10μL1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条，具有依次排列的样品垫、金标垫、NC膜和吸水垫，其特征在于：/n其中，由保藏号为CGMCC No.18841的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体4F4作为金标抗体偶联胶体金，并同时将所述单克隆抗体4F4作为检测抗体，所述金标抗体偶联胶体金后喷涂于所述金标垫上，所述检测抗体喷涂于所述NC膜上形成检测线。/n

【技术特征摘要】
1.一种人葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条，具有依次排列的样品垫、金标垫、NC膜和吸水垫，其特征在于：
其中，由保藏号为CGMCCNo.18841的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体4F4作为金标抗体偶联胶体金，并同时将所述单...

【专利技术属性】
技术研发人员：田亚晨，
申请(专利权)人：上海理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31