红细胞膜分离液和红细胞膜分离方法技术

本文提供了一种红细胞膜分离液，其包括腺嘌呤0.2‑0.4g/L、海藻糖6‑9g/L、氯化钠0.5‑1.0g/L、以及磷酸二氢钠0.01g/L‑0.03g/L。本文还提供了利用该分离液来制备红细胞膜的方法。通过该方法制备的红细胞膜基本上无血红蛋白残留。

【技术实现步骤摘要】
红细胞膜分离液和红细胞膜分离方法
本文涉及用于制备红细胞膜的红细胞膜分离液，还涉及利用所述红细胞膜分离液来制备红细胞膜的方法。
技术介绍
在生物学实验以及临床检验中，经常需要检测或使用红细胞膜抗原。这些膜抗原通常难以从红细胞膜上纯化出来，或者纯化后影响了其本身的生物学活性，例如抗原性。但是，在很多情况下，可以直接使用带有膜抗原的红细胞膜(或膜碎片)来进行这些试验。现有技术中红细胞膜的制备主要是通过低渗法制备。例如，CN101109755A公开了采用低渗法制备红细胞膜蛋白的过程，包括加预冷的0.01mol/LTric-HCl与红细胞混合(V：V=40：1)，4℃放置2h，再以9000r/min离心20min，重复多次，至无肉眼可见的红细胞为止。其他低渗方法还包括以蒸馏水或低渗PBS处理红细胞后再进行离心。另外，CN106754692公开了一种通过反复冻融来制备红细胞膜的方法。这些方法在红细胞膜制备过程中，受红细胞的洗涤、红细胞膜破碎和分离的影响，经常有不同程度的血红蛋白残留进入所制备的膜样品中。血红蛋白是红细胞的主要组成部分，膜样品中残留血红蛋白，为后续膜样品作为原料运用，例如在硝酸纤维素膜(NC膜)上的固定以及在样品的纯度上产生干扰。产生干扰的原因主要有三点：1)血红蛋白本身有颜色，膜样品固定NC膜上，呈现肉眼可见的颜色干扰；2)血红蛋白的卟啉环具有明显的氧化反应活性，可催化辣根过氧化物酶(HRP)的底物发生颜色反应，从而造成ELISA及部分HRP参与的层析检测干扰；3)血红蛋白的卟啉环本身具有自发荧光，且荧光反应比较强烈，对荧光层析反应存在干扰。现有红细胞膜制备方法并未考虑血红蛋白残留对后续实验的影响，也未能有效除去残留的血红蛋白。
技术实现思路
一方面，本文提供了一种红细胞膜分离液，其包括：腺嘌呤0.2-0.4g/L、海藻糖6-9g/L、氯化钠0.5-1.0g/L、以及磷酸二氢钠0.01g/L-0.03g/L。在一些实施方案中，所述红细胞膜分离液包括：腺嘌呤0.3g/L、海藻糖7g/L、氯化钠0.7g/L、以及磷酸二氢钠0.02g/L。另一方面，本文提供了一种制备红细胞膜的方法，包括：1)提供压积红细胞；2)以红细胞膜分离液悬浮所述压积红细胞，让所述红细胞破碎产生膜碎片；以及3)在所述红细胞分离液中通过离心沉淀所述膜碎片，其中所述红细胞膜分离液包括：腺嘌呤0.2-0.4g/L、海藻糖6-9g/L、氯化钠0.5-1.0g/L、以及磷酸二氢钠0.01g/L-0.03g/L。在一些实施方案中，所述红细胞分离液包括腺嘌呤0.3g/L、海藻糖7g/L、氯化钠0.7g/L、以及磷酸二氢钠0.02g/L。在一些实施方案中，在步骤1)和步骤2)之间还包括以所述红细胞分离液对所述压积红细胞进行洗涤。在一些实施方案中，步骤2)所用红细胞膜分离液与所述压积红细胞的体积比不低于10：1。在一些实施方案中，步骤2)所用红细胞膜分离液与所述压积红细胞的体积比不低于40：1。在一些实施方案中，步骤2)包括在4℃下悬浮不少于2h。在一些实施方案中，在步骤3)中，在离心半径为10cm时，离心转速不低于9000r/min。在一些实施方案中，所述红细胞为人红细胞。本文提供的红细胞分离液可以使制备的红细胞膜中血红蛋白基本上全部去除，增强了红细胞膜抗原的纯度，避免了进行后续试验时的血红蛋白干扰。具体实施方式除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。“红细胞膜”指来自红细胞的细胞膜。在本文中，由于需要红细胞破碎以释放出其中的血红蛋白，因此所制备的红细胞膜不必是完整的红细胞膜(即红细胞血影)，而可以是红细胞破碎后产生的膜碎片。这些红细胞血影和膜碎片可通过离心作为沉淀物与其他成分(如血红蛋白)分开。这种沉淀物在本文中也称为“膜样品”或“红细胞膜样品”。另外，为了叙述方便，本文并不对溶液或沉淀物中的红细胞血影和膜碎片进行区分，而是将它们统称为“膜碎片”。“压积红细胞”指通过离心除去全血中白细胞、血小板和大部分血浆后剩余的主要含红细胞的部分。可视情况进行多次离心以获得洁净的压积红细胞。制备压积红细胞的方法在本领域内是公知的。本文提供的红细胞膜制备方法部分地基于专利技术人意外地发现，采用特定成分的分离液有利于大大减少制备的膜样品中的血红蛋白残留量。结合适当的离心转速，可以使红细胞膜样品中血红蛋白的残存量小于0.01mg/L，甚至小于1μg/L。所用的红细胞分离液包括：腺嘌呤0.2-0.4g/L、海藻糖6-9g/L、氯化钠0.5-1.0g/L、以及磷酸二氢钠0.01g/L-0.03g/L。这里所用的“包括”旨在表明该红细胞分离液中还可以含有其他成分，例如水和少量的其他成分或杂质，只要这种少量其他成分或杂质的存在并不影响使用该红细胞分离液来制备膜样品。例如，在非限定性实例中，该红细胞分离液还可以含有少量抑菌剂。以下通过具体实施例来进一步阐述本专利技术的技术方案。主要实验材料和设备人血红蛋白(HB)酶联免疫吸附检测试剂盒：上海扶生实业有限公司货号，A097153酶标仪：德铁酶标仪，型号HBS-1096A离心机：北京白洋高速冷冻离心机，型号BY-R20，转子型号15mLx8，离心半径约10cm实施例1血红蛋白浓度测定方法本实施例阐述血红蛋白浓度的测定方法，其用于在下文实施例中测定制备的红细胞膜样品中的血红蛋白浓度。采用人血红蛋白(HB)酶联免疫吸附检测试剂盒进行血红蛋白浓度检测。检测原理：用抗人HB抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的人HB会与包被抗体结合，游离成分被洗去。依次加入生物素化的抗人HB抗体和辣根过氧化酶标记亲和素。抗人HB抗体与结合在包被抗体上的人HB结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加入终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，HB浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样本中HB的浓度。样品检测准备过程：1.取500μL离心后的沉淀物(即红细胞膜样品)悬浮于1mL0.01mol/LPBS(pH7.2)中，5000r/min离心10min，取上清液进行检测。2.提前20min从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。检测过程(参考试剂盒说明书)：1.标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。2.加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步骤相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后加待测样品10μL(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板空底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。3.加酶：每孔加入酶标试剂100μL，空白孔除本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.红细胞膜分离液，包括：腺嘌呤0.2-0.4g/L、海藻糖6-9g/L、氯化钠0.5-1.0g/L、以及磷酸二氢钠0.01g/L-0.03g/L。/n

【技术特征摘要】
1.红细胞膜分离液，包括：腺嘌呤0.2-0.4g/L、海藻糖6-9g/L、氯化钠0.5-1.0g/L、以及磷酸二氢钠0.01g/L-0.03g/L。


2.如权利要求1所述的红细胞膜分离液，包括：腺嘌呤0.3g/L、海藻糖7g/L、氯化钠0.7g/L、以及磷酸二氢钠0.02g/L。


3.制备红细胞膜的方法，包括：
1)提供压积红细胞；
2)以红细胞膜分离液悬浮所述压积红细胞，让所述红细胞破碎产生膜碎片；以及
3)在所述红细胞分离液中通过离心沉淀所述膜碎片，
其中所述红细胞膜分离液包括：腺嘌呤0.2-0.4g/L、海藻糖6-9g/L、氯化钠0.5-1.0g/L、以及磷酸二氢钠0.01g/L-0.03g/L。


4.如权利要求3所述的方法，其中所述红细胞分离液包...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丽，王秀柱，黄志刚，王伟权，庞伟，
申请(专利权)人：天津德祥生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12