一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒及提取方法技术

本发明专利技术公开了一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒及提取方法，具体涉及核酸提取技术领域，所述试剂盒包括蛋白酶处理液、裂解液、纳米磁珠、洗涤液和洗脱液；提取方法为：利用生理盐水和蛋白酶处理液处理离心的样本；加入裂解液、异丙醇和纳米磁珠震荡后静置；采用纳米磁珠多次吸附核酸；最后干燥、水浴洗脱即得病原体核酸。本发明专利技术提取纯化步骤简单、操作过程安全便捷、病原体核酸含量高，纯度高，通过简单的操作步骤得到高纯度、高浓度的病原体核酸，方便研究人员进行后续的检测。

【技术实现步骤摘要】
一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒及提取方法
本专利技术实施例涉及核酸提取
，具体涉及一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒及提取方法。
技术介绍
口腔由于呼吸和进食，会存留大量种类繁多的细菌。正常人咽峡部培养应有口腔正常菌群，而无致病菌生长。但在机体全身或局部抵抗力下降和其他外部因素下可以出现感染等而导致疾病，如呼吸道感染、流感等。因此，咽拭子分泌物中病原体(细菌、病毒、衣原体等)的检测，是临床上重要的诊断手段。目前病原体核酸提取纯化的方法有很多种，如离心柱法和磁珠法。这些方法各有优缺点，但都应考虑以下原则：将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净；排除有机溶剂和金属离子的污染。基于纳米磁珠的提取技术是利用亲水性纳米磁珠特异性地吸附样品溶液中的核酸，在外加磁场的作用将吸附的核酸-磁珠复合物从样品溶液中分离，通过洗涤液洗涤去除溶液中的蛋白和盐离子，最后在仅留有特异吸附核酸的磁珠中加入洗脱液，将核酸释放于洗脱液中。磁珠法提取病原体核酸与离心柱法相比，操作简单，不易污染，已经成为目前分子生物学和临床检验医学研究的理想方法。但是现有纳米磁珠提取技术还存在以下不足：提取纯化步骤较多，操作繁琐，所得病原体核酸含量底，且纯度不高，不能够直接用于后续检测。
技术实现思路
为此，本专利技术实施例提供一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒及提取方法，提取纯化步骤少，操作简便，整个过程不涉及有毒试剂，安全便捷，所得病原体核酸含量高，纯度高，可直接用于后续检测，以解决现有技术中存在的问题。为了实现上述目的，本专利技术实施例提供如下技术方案：一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒，所述试剂盒包括蛋白酶处理液、裂解液、纳米磁珠、洗涤液和洗脱液；本专利技术还提供了一种咽拭子样本中病原体核酸的提取方法，包括如下步骤：步骤S1：取一新鲜咽拭子样本于1.5ml离心管中，使用无菌移液枪头向该离心管中加入300ul生理盐水和10-40ul蛋白酶处理液，震荡混匀1min，56℃水浴静置10min；步骤S2：取50-200ul步骤S1中的样本处理液于1.5ml离心管中，使用无菌移液枪头向该离心管中加入75-300ul裂解液、75-300ul异丙醇和纳米磁珠5-20ul，震荡混匀1min，室温静置10min；步骤S3：将步骤S2中的离心管置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸弃上清溶液；步骤S4：使用无菌移液枪头向步骤S3离心管中加入300-800ul洗涤液，将该离心管震荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸弃上清溶液；步骤S5：重复步骤S4一次；步骤S6：室温开盖干燥5-20min直至管内无液体残留；步骤S7：使用无菌移液枪头向步骤S6离心管中加入100-200ul洗脱液，56℃水浴5-10min；步骤S8：将步骤S7离心管震荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸取上清至新的离心管，即获得样本中的病原体核酸。进一步地，步骤S1中所述的蛋白酶处理液浓度为10-200mg/ml。进一步地，所述蛋白酶处理液包括蛋白酶K，且蛋白酶K浓度为10-50mg/ml。进一步地，所述裂解液包括异硫氰酸胍、碘化锂、柠檬酸、Tween20，其中异硫氰酸胍浓度为3-5mM，碘化锂浓度为1-5M，柠檬酸三钠浓度为50-200mM，Tween20浓度为1％-5％，所述裂解液pH值为4.0-7.0。进一步地，步骤S2中所述的纳米磁珠添加浓度为50-200mg/ml。进一步地，所述纳米磁珠为包裹有二氧化硅的Fe3O4，所述纳米磁珠直径为200-2000nm，浓度为50-200mg/ml。进一步地，所述洗涤液包括Tris-HCL、NaCL和无水乙醇，所述Tris-HC的pH为6.5-8.5，浓度为1-5mM，所述NaCL浓度为10-50mM，所述无水乙醇浓度为40％-80％。进一步地，所述洗脱液为无菌DEPC水，pH值为7.0-9.0。本专利技术实施例具有如下优点：本专利技术病原体核酸提取试剂盒采用蛋白酶处理液、裂解液、纳米磁珠、洗涤液和洗脱液，采用该试剂盒进行核酸提取，提取过程不涉及有毒试剂，安全便捷，且提取方法具有提取纯化步骤少，操作简便，所得病原体核酸含量高，纯度高，可直接用于后续检测的优点。附图说明为了更清楚地说明本专利技术的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引申获得其它的实施附图。本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本专利技术可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本专利技术所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本专利技术所揭示的
技术实现思路
得能涵盖的范围内。图1为本专利技术实施例1提供的咽拭子样本呼吸道合胞病毒提取产物及其稀释物采用荧光PCR检测的扩增曲线。图2为本专利技术实施例2提供的咽拭子样本柯萨奇病毒A组16型提取产物及其稀释物采用荧光PCR检测的扩增曲线。图3为本专利技术实施例3提供的咽拭子样本肠道病毒71型提取产物采用荧光PCR检测的扩增曲线。图4为本专利技术实施例4提供的咽拭子样本流感病毒提取产物采用荧光PCR检测的扩增曲线。具体实施方式以下由特定的具体实施例说明本专利技术的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。该实施例的一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒，所述试剂盒包括蛋白酶处理液、裂解液、纳米磁珠、洗涤液和洗脱液；进一步地，所述蛋白酶处理液包括蛋白酶K，且蛋白酶K浓度为10-50mg/ml。进一步地，所述裂解液包括异硫氰酸胍、碘化锂、柠檬酸、Tween20，其中异硫氰酸胍浓度为3-5mM，碘化锂浓度为1-5M，柠檬酸三钠浓度为50-200mM，Tween20浓度为1％-5％，所述裂解液pH值为4.0-7.0。进一步地，所述纳米磁珠为包裹有二氧化硅的Fe3O4，所述纳米磁珠直径为200-2000nm，浓度为50-200mg/ml。进一步地，所述洗涤液包括Tris-HCL、NaCL和无水乙醇，所述Tris-HC的pH为6.5-8.5，浓度为1-5mM，所述NaCL浓度为10-50mM，所述无水乙醇浓度为40％-80％。进一步地，所述洗脱液为无菌DEPC水，pH值为7.0-9.0。本专利技术还提供了一种本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒及提取方法，其特征在于：所述试剂盒包括蛋白酶处理液、裂解液、纳米磁珠、洗涤液和洗脱液；利用该试剂盒进行病原体核酸提取的方法如下：/n步骤S1：取一新鲜咽拭子样本于1.5ml离心管中，使用无菌移液枪头向该离心管中加入300ul生理盐水和10-40ul蛋白酶处理液，震荡混匀1min，56℃水浴静置10min；/n步骤S2：取50-200ul步骤S1中的样本处理液于1.5ml离心管中，使用无菌移液枪头向该离心管中加入75-300ul裂解液、75-300ul异丙醇和纳米磁珠5-20ul，震荡混匀1min，室温静置10min；/n步骤S3：将步骤S2中的离心管置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸弃上清溶液；/n步骤S4：使用无菌移液枪头向步骤S3离心管中加入300-800ul洗涤液，将该离心管震荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸弃上清溶液；/n步骤S5：重复步骤S4一次；/n步骤S6：室温开盖干燥5-20min直至管内无液体残留；/n步骤S7：使用无菌移液枪头向步骤S6离心管中加入100-200ul洗脱液，56℃水浴5-10min；/n步骤S8：将步骤S7离心管震荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸取上清至新的离心管，即获得样本中的病原体核酸。/n...

【技术特征摘要】
1.一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒及提取方法，其特征在于：所述试剂盒包括蛋白酶处理液、裂解液、纳米磁珠、洗涤液和洗脱液；利用该试剂盒进行病原体核酸提取的方法如下：
步骤S1：取一新鲜咽拭子样本于1.5ml离心管中，使用无菌移液枪头向该离心管中加入300ul生理盐水和10-40ul蛋白酶处理液，震荡混匀1min，56℃水浴静置10min；
步骤S2：取50-200ul步骤S1中的样本处理液于1.5ml离心管中，使用无菌移液枪头向该离心管中加入75-300ul裂解液、75-300ul异丙醇和纳米磁珠5-20ul，震荡混匀1min，室温静置10min；
步骤S3：将步骤S2中的离心管置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸弃上清溶液；
步骤S4：使用无菌移液枪头向步骤S3离心管中加入300-800ul洗涤液，将该离心管震荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸弃上清溶液；
步骤S5：重复步骤S4一次；
步骤S6：室温开盖干燥5-20min直至管内无液体残留；
步骤S7：使用无菌移液枪头向步骤S6离心管中加入100-200ul洗脱液，56℃水浴5-10min；
步骤S8：将步骤S7离心管震荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸取上清至新的离心管，即获得样本中的病原体核酸。


2.根据权利要求1所述的一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒及提取方法，其特征在于：步骤S1中所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖理慧，孙凤娟，王庆专，
申请(专利权)人：上海领骏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31