本发明专利技术涉及深海微生物领域，特别涉及深海原位细胞裂解组合物、裂解液、试剂盒及其应用。该方法可以在深海低温高压条件下直接获取海水中微生物的核酸。首先通过装置的海水泵将大量海水过滤到滤膜腔中，完成海水中微生物的富集；再通过蠕动泵将裂解液注入到滤膜腔，通过化学裂解方式破坏蛋白从而释放核酸；最后使用核酸吸附柱对核酸进行回收和保存；同时依靠深海核酸提取装置，可以一次获得多达9组的深海海水中微生物的核酸样品。本发明专利技术的技术方案中使用的裂解液与商业常温裂解液具有等同效用，且可以有效的避免传统采样方式中由于温度、压力等变化对核酸的影响。目前该技术方法已经成功用于全海深微生物核酸原位提取装置，获得微克级的核酸量。
【技术实现步骤摘要】
用于深海微生物原位细胞裂解的组合物、试剂、试剂盒及应用
本专利技术涉及深海微生物领域，特别涉及深海原位细胞裂解组合物、裂解液、试剂盒及其应用。
技术介绍
深海生物在整个海洋甚至全球的生态系统中扮演着重要角色。采集不同深度海水中的生物样品，是现代海洋学研究的重要内容。随着各种海洋科学研究与海洋资源开发利用的不断深入，如何快速、方便和有效地对海洋生物进行调查采样，以获得第一手的海洋生物科学研究样品，全面了解特定海域的生物资源情况，成为了当务之急。和传统的采样分析相比，近年发展起来的深海原位细胞富集采样是最有效的深海生物核酸获取手段，是对传统海洋生物学研究方法的一次重大突破。深海高压低温，如何在原位环境中使深海生物细胞裂解并提取核酸是深海微生物研究的难题。尤其是原位获得的高质量RNA是研究深海生物基因功能的前提。深海核酸提取仪采用泵连接过滤腔(内含生物滤膜)的方式对海水大通量过滤。当过滤足量的海水体积后，触发转换阀切换管路，使泵的入口由海水切换为细胞裂解液，通过置换管路内原有的海水实现过滤腔内微生物和幼虫的细胞支撑蛋白裂解。收集的核酸可以用于高通量测序来研究深海生物的宏基因组和转录组。因此，深海原位富集细胞裂解液对于原位获得深海生物核酸具有重要的现实意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了用于深海微生物原位细胞裂解的组合物、试剂、试剂盒及应用。该方法可以在深海低温高压条件下直接获取海水中微生物的核酸。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了用于深海微生物原位细胞裂解的组合物，包括：Tris-HCl25～50mM、NaCl100～200mM、EDTA1～10mM、TritonX-1001～2％(v/v)、溶菌酶3～5mg/ml、SDS0.05～0.1％(v/v)、蛋白酶K10～20μl/ml。在本专利技术的一些具体实施方案中，组合物包括：Tris-HCl50mM、NaCl150mM、EDTA1mM、TritonX-1001％(v/v)、溶菌酶3mg/ml、SDS0.05％、蛋白酶K20μl/ml。在上述研究的基础上，本专利技术还提供了所述的组合物在制备深海微生物原位细胞裂解的试剂和/或试剂盒中的应用。本专利技术还提供了所述的组合物在制备深海微生物原位核酸提取的试剂和/或试剂盒中的应用。本专利技术还提供了所述的组合物在制备深海微生物核酸检测的试剂和/或试剂盒中的应用。在上述研究的基础上，本专利技术还提供了深海微生物原位细胞裂解的试剂或试剂盒，包括所述的组合物以及可接受的助剂。在上述研究的基础上，本专利技术还提供了深海微生物原位核酸提取的试剂或试剂盒，包括所述的组合物以及可接受的助剂。在上述研究的基础上，本专利技术还提供了深海微生物核酸检测的试剂或试剂盒，包括所述的组合物以及可接受的助剂。在上述研究的基础上，本专利技术还提供了深海微生物原位细胞裂解的方法，采用所述的组合物或所述的深海微生物原位细胞裂解的试剂或试剂盒。在上述研究的基础上，本专利技术还提供了深海微生物原位核酸提取和/或检测的方法，采用所述的组合物或所述的深海微生物原位核酸提取的试剂或试剂盒或所述的深海微生物核酸检测的试剂或试剂盒。本专利技术提供的一套可以适用于全海深的原位核酸提取及回收的方法，该方法有效的简化了实验室深海微生物样品的提取方式，使其可以置于深海中进行原位的提取；本专利技术中的配置的裂解液可以有效地裂解包括厚壁菌在内的深海细菌和微生物，获得与常规实验室使用试剂盒等量的核酸；与现有的深海采样技术相比较，该系统的采样流程可以有效的避免由于温度、压力等条件改变而影响原位核酸，也避免了实验室提取过程可能存在的污染；此外，本专利技术配合全海深微生物核酸原位提取装置可以完成在一次下潜采样中获得多达9个海水微生物的核酸样品。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示RNA电泳图；其中图1(a)为南海北部1000m水样RNA电泳图，图1(b)为新鲜海水样品提取RNA图；图2示吸附条件对比实验流程图；图3示第一次均匀液体替换实验；图4示第二次均匀液体替换实验；图5示第三次均匀液体替换实验；图6示第一次盐溶液替换实验(单位：ppt)；图7示第二次盐溶液替换实验(单位：ppt)；图8示第一次原位富集装置-管路替换实验(单位：ppt)；图9示第二次原位富集装置-管路替换实验(单位：ppt)；图10示第三次原位富集装置-管路替换实验(单位：ppt)；图11示核酸低温保存实验。具体实施方式本专利技术公开了用于深海微生物原位细胞裂解的组合物、试剂、试剂盒及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。为了成功在深海原位状态下获得海水中微生物的核酸，将提取过程分为三个步骤：微生物富集、细胞裂解和核酸回收。1、微生物富集：使用海水泵将海水注入已经安装有0.22um孔径的滤膜，富集微生物于滤膜上。使用阀门切换的方式可以改变管路通向，配合全海深微生物核酸原位提取装置上的多个滤膜腔，可以一次完成9组微生物样品的富集工作。优选9个滤膜腔。2、细胞裂解：针对深海高压低温的条件，本专利技术中配置了一种是可以适用于深海条件的细胞裂解液，有效地裂解深海生物细胞，获得高质量核酸。裂解的配方如下：Tris-HCl(50mM)：缓冲体系，提供合适的裂解环境；NaCl(150mM)：等渗体系，维持核酸结构的稳定；EDTA(1mM)：变性剂和稳定剂，抑制样品中的核酸酶在裂解工程中对核酸的破坏；TritonX-100(1％)：非离子型表面活性剂，破坏细胞膜(裂解细胞)以释放细胞内的可溶性物质；溶菌酶(3mg/ml)：催化水解糖苷键，破坏细胞壁中的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂；SDS(0.05％)：阴离子表面活性剂，溶解细胞膜上的脂质和蛋白从而破坏细胞；蛋白酶K(20μl/ml)：降解蛋白质，使蛋白质变小，促进蛋白质的游离，防止蛋白质和DNA结合。微生物富集完成后，通过阀门的切换，将海水泵管路切换为裂解液注入蠕动泵。向滤膜腔中注入裂解液置换滤膜腔内海水，并静置30min裂解细胞。裂解完成后，同时打开裂解液注入蠕动泵和装置后端的乙醇注入蠕动泵，混合后的液体用于后续核酸回收。3、核酸回收：核酸回收方式选择使用吸附柱进行回收。将上述混合后的液体在蠕动泵的作用下，缓慢注入吸附柱中，混合液中的核酸会吸附于吸附柱上。配合全海深微生物核酸原位提取装置上的多个吸附本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于深海微生物原位细胞裂解的组合物，其特征在于，包括：Tris-HCl 25～50mM、NaCl 100～200mM、EDTA 1～10mM、TritonX-1001～2％(v/v)、溶菌酶3～5mg/ml、SDS0.05～0.1％(v/v)、蛋白酶K10～20μl/ml。/n
【技术特征摘要】
1.用于深海微生物原位细胞裂解的组合物，其特征在于，包括：Tris-HCl25～50mM、NaCl100～200mM、EDTA1～10mM、TritonX-1001～2％(v/v)、溶菌酶3～5mg/ml、SDS0.05～0.1％(v/v)、蛋白酶K10～20μl/ml。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，包括：Tris-HCl50mM、NaCl150mM、EDTA1mM、TritonX-1001％(v/v)、溶菌酶3mg/ml、SDS0.05％、蛋白酶K20μl/ml。
3.如权利要求1或2所述的组合物在制备深海微生物原位细胞裂解的试剂和/或试剂盒中的应用。
4.如权利要求1或2所述的组合物在制备深海微生物原位核酸提取的试剂和/或试剂盒中的应用。
5.如权利要求1或2所述的组合物在制备深海微生...
【专利技术属性】
技术研发人员：李文莉，王勇，位站飞，李俊，高兆明，贺丽生，
申请(专利权)人：中国科学院深海科学与工程研究所，
类型：发明
国别省市：海南;46
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