一种草鱼肠系膜脂肪组织高质量总RNA的提取方法技术

本发明专利技术公开了一种草鱼肠系膜脂肪组织高质量总RNA的提取方法,包括样品液氮速冻，TRIzol试剂裂解与机械匀浆，离心去除油脂层，氯仿分离含RNA水相，异丙醇沉淀和75％乙醇洗涤等步骤。在样品前处理阶段，本发明专利技术通过增加取样量至30mg,可提升产量以满足常规分子生物学实验对RNA量的需求；样品采用液氮速冻,无需人工研磨，并将冻样在TRIzol试剂中进行长时间机械匀浆，时长3min,可显著降低RNA降解发生,同时增加2次离心去除油脂层等操作步骤,获得的总RNA纯度和完整性较高。本发明专利技术的提取方法有效解决了草鱼脂肪组织RNA提取易降解，产量低等问题，且操作简单，批处理效果稳定，可满足转录组测序等高质量RNA要求的实验，也适用于其它鱼类脂肪组织总RNA的提取。

【技术实现步骤摘要】
一种草鱼肠系膜脂肪组织高质量总RNA的提取方法
本专利技术涉及鱼类RNA提取领域，具体涉及一种草鱼肠系膜脂肪组织高质量总RNA的提取方法。
技术介绍
动物脂肪组织不仅是机体能量贮存库，也是活跃的内分泌器官，其分泌的多种激素和细胞因子在机体代谢平衡、免疫应答等方面发挥重要作用(Scherer,2006；Wellen,Hotamisligil,2003)。在组织功能研究中，分子水平研究必不可少，其中RNA提取纯化是常涉及的分子生物学实验技术。然而，由于脂肪组织含有丰富油脂，RNA丰度低，导致高质量总RNA提取常常存在一定难度，影响到下游实验的高效开展。目前，RNA提取广泛采用经典的酸性酚-异硫氰酸胍-氯仿一步提取法(Chomczynski,Sacchi,1987)。该方法具有操作便捷，无需复杂设备辅助等优点，并配备有成熟的TRIzol等即用型商品化试剂(Wilfingeretal.,2010)。针对脂肪组织RNA含量低、难提取等问题，大多学者选择在一步法基础上进行优化改良。例如，吴江维等(2006)以猪脂肪组织为材料，发现增加样品量，延长静置裂解时间，去除油脂层污染等操作，可改善RNA提取的质量。采用类似优化步骤，在肉牛、绵羊等动物脂肪组织也获得了较高质量的总RNA样品(李娜等,2018；徐红伟等,2008)。草鱼(Ctenopharyngodonidella)是中国养殖产量最高的淡水经济鱼类，养殖过程中通常出现体脂过度沉积现象(姜鹏等,2019)。试验发现，常规方法操作下，草鱼脂肪组织RNA提取易发生降解，干扰到后续分子生物学实验的有序推进。草鱼脂肪组织主要蓄积在腹腔肠道周围，与哺乳动物的脂肪组织相比，质地构造存在明显差异。试验还发现，目前公开的优化改良方法或策略未能稳定获得高质量的草鱼脂肪组织RNA。因此，有必要研究开发一种草鱼脂肪组织高质量总RNA的提取方法，以解决目前存在的难题。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术旨在提供一种草鱼肠系膜脂肪组织高质量总RNA的提取方法，通过对常规酸性酚-异硫氰酸胍-氯仿一步提取法进行优化改进，实现对草鱼肠系膜脂肪组织高质量总RNA的高效提取。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种草鱼肠系膜脂肪组织高质量总RNA的提取方法，所述提取方法包括：在前处理阶段，草鱼肠系膜脂肪组织样品采用液氮速冻，并在TRIzol试剂中进行长时间机械匀浆。优选的，草鱼肠系膜脂肪组织在TRIzol试剂中机械匀浆时间为3min。优选的，在前处理阶段将草鱼肠系膜脂肪组织放入液氮中速冻，冻样在TRIzol试剂裂解前无需进行人工或机械研磨粉碎。本专利技术同时提供一种草鱼肠系膜脂肪组织高质量总RNA的具体提取方法，包括前处理阶段和后提取阶段，其中，前处理阶段包括以下步骤：(1)将清洁好的匀浆器转头，用锡纸包裹，150℃高温处理2h，待降至室温后放入-20℃低温冰箱预冷备用,以避免随后的长时间匀浆操作引起转头过热而造成RNA分解；(2)取1.5mL离心管，加入1.3mLTRIzol试剂，放入-20℃冰箱中预冷备用；(3)将草鱼麻醉，剪断其颈椎放血后解剖，快速取肠系膜脂肪组织约30mg，迅速放入液氮中速冻；(4)取出上述离心管、匀浆器转头放置在冰盒上，再把上述冻样加入到离心管中，立即机械研磨匀浆3min，之后进行离心操作；(5)将匀浆后的脂肪组织于4℃离心5min，离心后小心吸弃200μL上层油脂；(6)于4℃再离心3min，离心后再吸弃100μL上层油脂，并将下层大部分液体转移至另一新离心管，勿吸取底层杂质，之后进行RNA萃取操作。作为一种优选的技术方案,后提取阶段包括以下步骤:(7)往上述新离心管中加入300μL氯仿，盖紧离心管，上下剧烈震荡15s，之后室温放置5min；(8)将离心管于4℃离心15min，离心后小心吸取上层水相移入另一新离心管中；(9)往新离心管中加入500μL异丙醇，上下颠倒混匀，室温孵育5min；(10)将离心管于4℃离心15min，至管底可见白色RNA沉淀物，弃上清液，再次简短离心并小心吸弃管底残液；(11)往离心管中加入1.3mL由DEPC水配制的75％乙醇，上下颠倒离心管，洗涤白色RNA沉淀物，之后4℃离心5min，弃上清液，再次简短离心并吸弃管底残余液体；(12)挥发干燥约5min，得白色沉淀物质即为高质量的草鱼肠系膜脂肪组织总RNA。作为一种优选的技术方案,步骤(5)、步骤(6)、步骤(8)、步骤(10)离心操作时离心的转速均为12000g；步骤(11)离心操作时离心的转速小于7500g。作为一种优选的技术方案,步骤(6)中下层液体的吸取量为0.8～1.0mL。作为一种优选的技术方案,步骤(7)中所述氯仿预先经过冰冷。作为一种优选的技术方案，步骤(8)中将上层水相移入新离心管的次数为3次，前两次分别移入200μL，后一次移入不超过100μL。作为一种优选的技术方案,后处理阶段还包括以下步骤：(13)根据白色沉淀物质的量，加入30～50μLDEPC水溶解RNA，轻弹管底促进溶解，之后简短离心；(14)跑胶检测提取效果，测量OD值，最后将总RNA样品于-80℃中保存备用。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本专利技术所提供的提取方法通过增加取样量至约30mg,可提升产量以满足常规分子生物学实验对RNA量的需求；样品采用液氮速冻,无需人工研磨，并将冻样在TRIzol试剂中进行长时间机械匀浆，时长约3min,可显著降低RNA降解发生,同时增加2次离心去除油脂层等操作步骤,获得的总RNA纯度和完整性较高。本方法有效解决了草鱼脂肪组织RNA提取易降解、产量低等问题，且操作简单，批处理效果稳定，可满足转录组测序等高质量RNA要求的实验，也适用于其它鱼类脂肪组织总RNA的提取。附图说明图1是T1-T8组的琼脂糖凝胶电泳检测结果图；图2是T8组Agilent2200生物分析仪生成的凝胶样图像及电泳色谱峰图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。在未作特别说明的情况下，本专利技术所采用的试剂、设备和方法均为本
常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。1.材料与方法1.1试验用鱼试验所用草鱼取自中国水产科学研究院珠江水产研究所生物技术养殖基地。从正常饲养的养殖群体中随机挑选健康个体，体质量范围约为80～150g。1.2试验耗材与仪器TRIzol试剂选用TaKaRa公司RNAisoPlus产品(CodeNo.9108)，DEPC水购自Beyotime公司，氯仿和异丙醇试剂为国产分析纯，PRO200型精密匀浆器购自PROScientific公司(美国)，高速冷冻离心机5417R购自Eppendorf公司(德国)，TGem微量分光光度计(OSE-260)购自天本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种草鱼肠系膜脂肪组织高质量总RNA的提取方法，其特征在于，在前处理阶段，草鱼肠系膜脂肪组织样品采用液氮速冻，并在TRIzol试剂中进行长时间机械匀浆。/n

【技术特征摘要】
1.一种草鱼肠系膜脂肪组织高质量总RNA的提取方法，其特征在于，在前处理阶段，草鱼肠系膜脂肪组织样品采用液氮速冻，并在TRIzol试剂中进行长时间机械匀浆。


2.根据权利要求1所述的草鱼肠系膜脂肪组织高质量总RNA的提取方法，其特征在于，草鱼肠系膜脂肪组织在TRIzol试剂中机械匀浆时间为3min。


3.根据权利要求1所述的草鱼肠系膜脂肪组织高质量总RNA的提取方法，其特征在于，在前处理阶段将草鱼肠系膜脂肪组织放入液氮中速冻，冻样在TRIzol试剂裂解前无需进行人工或机械研磨粉碎。


4.一种草鱼肠系膜脂肪组织高质量总RNA的提取方法，其特征在于，包括前处理阶段和后提取阶段，前处理阶段包括以下步骤：
(1)将清洁好的匀浆器转头，用锡纸包裹，150℃高温处理2h，待降至室温后放入-20℃低温冰箱预冷备用；
(2)取1.5mL离心管，加入1.3mLTRIzol试剂，放入-20℃低温冰箱中预冷备用；
(3)将草鱼麻醉，剪断其颈椎放血后解剖，快速取肠系膜脂肪组织30mg，迅速放入液氮中速冻；
(4)取出上述离心管、匀浆器转头放置在冰盒上，再把上述冻样加入到离心管中，立即机械研磨匀浆3min，之后进行离心操作；
(5)将匀浆后的脂肪组织于4℃离心5min，离心后小心吸弃200μL上层油脂；
(6)于4℃再离心3min，离心后再吸弃100μL上层油脂，并将下层大部分液体转移至另一新离心管，勿吸取底层杂质，之后进行RNA萃取操作。


5.根据权利要求4所述的草鱼肠系膜脂肪组织高质量总RNA的提取方法，其特征在于，后处理阶段包括以下步骤：
(7)往上述新离心管中加入300μL氯仿，盖紧离心管，上下剧烈震荡15s，之后室温放置5min；
(8)将...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜鹏，李胜杰，樊佳佳，马冬梅，杜金星，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44