一种高效提取动物血液中DNA的方法技术

本发明专利技术涉及一种高效提取动物血液中DNA的方法，其步骤包括：先加蛋白质消化酶至离心管底，再加细胞裂解液，再加血液样本后加高速涡旋震荡，65度水浴孵育20分钟，加无水乙醇充分混匀再离心获得血液DNA消化裂解液；然后用硅胶膜柱子进行漂洗和洗脱，最后获得的离心液为动物血液DNA提取液，于‑20℃保存。本发明专利技术采用先加蛋白质消化酶至离心管底部，再加细胞裂解液，再加血样的加液方式，并且延长蛋白质消化酶的消化时间达到20分钟，获得DNA得率能提高159%、每24个一批次的样本检测的移液枪枪头减少23个的技术进步，可以在使用市售常规试剂盒的基础上，显著降低动物血液单位DNA的提取成本。

【技术实现步骤摘要】
一种高效提取动物血液中DNA的方法
本专利技术涉及从血液中高效提取动物DNA的方法，具体涉及一种高效提取动物血液中DNA的方法。技术背景在不杀死动物的情况下，从血液中提取DNA进行后续检测、测序、遗传学及分子生物学研究是常用的生物学研究方法，其原理是采用蛋白质消化酶和裂解试剂裂解样品释放出核酸，然后加入有机溶剂使核酸沉淀出来或者吸附于固体介质，再吸弃上清液(废液)，再多次用洗涤液洗涤核酸，最后用溶解液溶解沉淀的核酸或将核酸从固体介质上洗脱下来。目前市场上，核酸纯化试剂盒从纯化方式上大体可以分为三类：离心沉淀抽提、纯化柱法、磁珠法，其中纯化柱法可以获得纯度比较高的核酸，因此应用最为广泛，很多试剂公司都推出相应的试剂盒及配套提取方法，辅助研究机构快速完成血液DNA的提取工作。作为一种公开销售的商业产品，DNA的得率和单位DNA的提取成本是影响技术实施方作出购买DNA提取试剂盒决定的关键因素，现有试剂盒的缺点主要就是DNA得率较低、单位DNA提取成本较高、不同批次操作之间的差异较大。这些问题经常被归结为试剂盒质量不可靠，为此研究人员需要购买更多的试剂盒做更多的提取工作，然后选取其中比较可靠的数据进行分析，这不仅增加了研究成本，而且对试剂盒厂家本身信誉方面也有影响。采用纯化柱法提取核酸的原理基本类似，但操作方法上差异却比较大，最常见的是加样顺序和孵育时间，加样顺序通常是先加血液样品，再加细胞核裂解液和蛋白质消化酶，或者先加细胞核裂解液，再加血液样品，再加蛋白质消化酶；消化孵育时间一般为10分钟，因为每个试管中加入的样本量很小，常规为250μl，通常认为这么小量的样本中蛋白质消化10分钟后即消化完全，孵育更长时间并不会对DNA得率有提升作用。但是血液DNA的单位提取成本较高的问题较为普遍，蛋白酶是最关键的因素，价格最高，在提取操作中用量也是最少，基本为25μl，蛋白酶的加液时机基本都采用后加入模式，即先加血液后加蛋白酶，加入时需要将移液枪头插入血液中，避免蛋白酶的加液损失。目前的优化研究都集中在改进试剂盒各种配液的配方，但对现有技术通过改进加液顺序和消化孵育时间是否会影响DNA得率尚无文献报道，另外，现有技术的提取过程涉及液体的多次转移，操作复杂，耗时长，易产生污染，效率低下，且需要大量试剂及其它耗材。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高效提取动物血液中DNA的方法。本专利技术的高效提取动物血液中DNA的方法，操作步骤如下：1)取25μl蛋白质消化酶至1.5ml离心管底，再加入250μl细胞裂解液；2)取250μl动物全血抗凝血加入步骤1)的离心管中，加入后即刻3000rpm高速涡旋震荡至少15秒；3)将步骤2)获得的混合液离心管在65度水浴孵育20分钟，其中孵育到10分钟时取出离心管，3000rpm涡旋震荡5秒，再放回水浴锅继续孵育10分钟，取出离心管10000g离心2秒；4)加260μl无水乙醇至步骤3)完成后的离心管中，即刻3000rpm高速涡旋震荡20秒以上至充分混匀，再将离心管于10000g离心2秒；5)将硅胶膜柱子放入2ml的新离心管中，将步骤4)得到的消化裂解液用1000μl的移液枪转入硅胶膜柱子中，然后离心管在10000g离心1分钟，弃液及离心管；6)将步骤5)获得的硅胶膜离心柱放入新的2ml离心管中，用500μl蛋白洗涤液冲洗，10000g离心1分钟，弃液；所述蛋白洗涤液为使用前在蛋白洗涤液原液中每80ml加入32ml异丙醇,混匀备用；7)在步骤6)获得的离心管中加入700μl漂洗液冲洗，10000g转离心1分钟，弃液；所述漂洗液为使用前在漂洗液原液中每25ml加入无水乙醇100ml,混匀备用；8)重复步骤7；9)将完成步骤8)后的离心管于12000g离心5分钟，让柱干燥；10)将完成步骤9)的硅胶膜离心柱取出后再置于无核酸酶的离心管中，加100-200μlDNA洗脱液，室温停留5分钟后，13000g转离心1分钟，分离并保留离心液，所述DNA洗脱液使用前要预热至65℃；11)将步骤10)获得的离心液再次加入步骤10)第一次洗脱后的硅胶膜离心柱中，室温停留5分钟后，13000g转离心1分钟，留液弃柱；12)步骤11)获得的离心液即为动物血液DNA提取液，于-20℃保存。进一步，步骤2)所述取250μl动物全血抗凝血加入步骤1)的离心管中，当血样不足250μl时用DNA洗脱液补足。进一步，当需要除去RNA时，则在步骤1)中加入5μlRNA酶，所述RNA酶浓度为50mg/ml。进一步，所述细胞裂解液、蛋白质消化酶、蛋白洗涤液原液、漂洗液原液、DNA洗脱液为市售OMEGA血液DNA提取试剂盒中的成品。本专利技术的有益效果如下：1、以调整加液顺序为优化手段，DNA提取率显著提高：本专利技术提出的高效提取动物血液中DNA的方法，首次对加液顺序进行了优化研究，发现采用先加蛋白质消化酶至离心管底部，再加细胞裂解液，再加血样的加液方式可以大幅提高DNA得率。从本专利技术的实施例中可看出，对提取血液中DNA而言，同样的提取试剂，不同的加液顺序，DNA得率并不相同，本专利技术的加液顺序与常规的先加血样后加蛋白质消化酶和细胞裂解液相比，如果配合本专利技术的消化时间及操作方法，DNA得率能提高159％之多，如果仅改变加液顺序，消化时间及其他操作方法还按常规方式进行，DNA得率也能提高42％。分析原因可能是核酸提取操作中，蛋白质消化酶用量太少，仅25μl，移液枪虽然能吸准确量的蛋白质消化酶，而常规方法先加血液后加蛋白质消化酶的方式，却不能保证移液枪中的蛋白质消化酶能完全加入离心管中，实际上移液枪的枪头上总会附带着一些蛋白质消化酶造成实际加入血样中的蛋白质消化酶的损失，而本专利技术先加蛋白质消化酶的方式，则保证了移液枪枪头能接触离心管管底，在这个基面的相互作用下，枪头内的蛋白质消化酶在张力作用下能被完全拉入离心管中，确保了蛋白质消化酶足量及时与血液发生反应；另一种可能性是，血液在与蛋白质消化酶及细胞裂解液发生作用过程中，先加血液的方式，血液与蛋白质消化酶及细胞裂解液事实上不能及时混合，而先加蛋白质消化酶，再加细胞核裂解液，才能实现加完血液后就即时震荡混匀，保证试剂与血液细胞的充分反应，预测可能是在消化和裂解反应发生之初，如果血液与蛋白质消化酶及细胞裂解液能及时混合，则单位血液与试剂发生初次反应的接触面积较大，产生的拮抗物质比先加血液的操作方式少，具体机制尚无文献报道。2、优化蛋白质消化酶的消化孵育时间，DNA提取率显著提高：本专利技术实施例中使用了山羊血液进行消化时间的优化实验，发现尽管只有250μl的血液，常规技术中蛋白质消化酶消化时间只要求10分钟，而且当消化孵育时间延长至15分钟时，DNA得率并没有显著变化，但是本专利技术的实施例发现当消化孵育时间延长至20分钟时，DNA得率又显著提高了83％，而继续延长消化孵育时间至25分钟时，DNA得率与20分钟相比就没有显著差异了。说明针对某些物种，或者某些个体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效提取动物血液中DNA的方法，其特征在于，操作步骤如下：/n1)取25μl蛋白质消化酶至1.5ml离心管底，再加入250μl细胞裂解液；/n2)取250μl动物全血抗凝血加入步骤1)的离心管中，加入后即刻3000rpm高速涡旋震荡至少15秒；/n3)将步骤2)获得的混合液离心管在65度水浴孵育20分钟，其中孵育到10分钟时取出离心管，3000rpm涡旋震荡5秒，再放回水浴锅继续孵育10分钟，取出离心管10000g离心2秒；/n4)加260ul无水乙醇至步骤3)完成后的离心管中，即刻3000rpm高速涡旋震荡20秒以上至充分混匀，再将离心管于10000g离心2秒；/n5)将硅胶膜柱子放入2ml的新离心管中，将步骤4)得到的消化裂解液用1000μl的移液枪转入硅胶膜柱子中，然后离心管在10000g离心1分钟，弃液及离心管；/n6)将步骤5)获得的硅胶膜离心柱放入新的2ml离心管中，用500μl蛋白洗涤液冲洗，10000g离心1分钟，弃液；所述蛋白洗涤液为使用前在蛋白洗涤液原液中每80ml加入32ml异丙醇,混匀备用；/n7)在步骤6)获得的离心管中加入700μl漂洗液冲洗，10000g转离心1分钟，弃液；所述漂洗液为使用前在漂洗液原液中每25ml加入无水乙醇100ml,混匀备用；/n8)重复步骤7；/n9)将完成步骤8)后的离心管于12000g离心5分钟，让柱干燥；/n10)将完成步骤9)的硅胶膜离心柱取出后再置于无核酸酶的离心管中，加100-200μlDNA洗脱液，室温停留5分钟后，13000g转离心1分钟，分离并保留离心液，所述DNA洗脱液使用前要预热至65℃；/n11)将步骤10)获得的离心液再次加入步骤10)第一次洗脱后的硅胶膜离心柱中，室温停留5分钟后，13000g转离心1分钟，留液弃柱；/n12)步骤11)获得的离心液即为动物血液DNA提取液，于-20℃保存。/n...

【技术特征摘要】
1.一种高效提取动物血液中DNA的方法，其特征在于，操作步骤如下：
1)取25μl蛋白质消化酶至1.5ml离心管底，再加入250μl细胞裂解液；
2)取250μl动物全血抗凝血加入步骤1)的离心管中，加入后即刻3000rpm高速涡旋震荡至少15秒；
3)将步骤2)获得的混合液离心管在65度水浴孵育20分钟，其中孵育到10分钟时取出离心管，3000rpm涡旋震荡5秒，再放回水浴锅继续孵育10分钟，取出离心管10000g离心2秒；
4)加260ul无水乙醇至步骤3)完成后的离心管中，即刻3000rpm高速涡旋震荡20秒以上至充分混匀，再将离心管于10000g离心2秒；
5)将硅胶膜柱子放入2ml的新离心管中，将步骤4)得到的消化裂解液用1000μl的移液枪转入硅胶膜柱子中，然后离心管在10000g离心1分钟，弃液及离心管；
6)将步骤5)获得的硅胶膜离心柱放入新的2ml离心管中，用500μl蛋白洗涤液冲洗，10000g离心1分钟，弃液；所述蛋白洗涤液为使用前在蛋白洗涤液原液中每80ml加入32ml异丙醇,混匀备用；
7)在步骤6)获得的离心管中加入700μl漂洗液冲洗，10000g转离心1分钟，弃液；所述漂洗液为使用前在漂洗液原液中每25ml加入无水乙醇100...

【专利技术属性】
技术研发人员：兰蓉，朱兰，洪琼花，欧阳依娜，邵庆勇，
申请(专利权)人：云南省畜牧兽医科学院，
类型：发明
国别省市：云南;53