一种适合沙棘的DNA提取方法技术

一种适合沙棘的DNA提取方法，本发明专利技术涉及一种适合沙棘的DNA提取方法。本发明专利技术的目的是解决现有提取沙棘DNA的方法存在DNA纯度低的问题，本发明专利技术通过研磨前预冷，去掉了部分糖类物质，在研磨加入了PVP，减少了酚类、单宁类物质的影响，络合多酚和萜类物质，防止多酚类褐变而氧化，去糖缓冲液去除了糖类物质，为后续提取高质量DNA打好基础；用在CTAB缓冲液中加入蛋白酶K，在加快细胞膜破裂的同时，蛋白酶协同步骤四的盐酸胍去除了沙棘DNA中的粗蛋白，提高了DNA的纯度和产量。制备出的DNA OD260/OD280值可达1.92，DNA的纯度较高。本发明专利技术应用于分子生物学领域。

【技术实现步骤摘要】
一种适合沙棘的DNA提取方法
本专利技术属于生物

技术介绍
沙棘为胡颓子科沙棘属，是一种落叶性灌木，为药食同源植物，其根、茎、叶、花、果，特别是沙棘果实含有丰富的营养物质和生物活性物质，具有止咳化痰、健胃消食、活血散瘀等功效。现代医学研究，沙棘可降低胆固醇，缓解心绞痛发作，还有防治冠状动脉粥样硬化性心脏病的作用；沙棘成长周期较长，一般3～4年才开花结果，为实现其经济价值，沙棘在分子生物学方面的研究亟待展开，便于后续在其优质种株鉴定，病虫害防治等方向的研究。进行分子生物学分析的关键第一步，是提取高质量的基因组DNA，这是获得准确试验结果的基础。沙棘组织中富含多糖、多酚和粗蛋白，这些次生代谢物会严重的阻扰DNA的提取纯化。现有CTAB法提取植物基因组织中的DNA，是在CTAB缓冲液中加入PVP以去除少许多糖，加上用Tris-酚:氯仿:异戊醇来抽提蛋白质，OD260/OD280比值低于1.8，说明仍有较多的多糖及蛋白质与DNA混杂在一起，DNA纯度低。因此需要更加有效的方法来解决提取DNA中存在多糖和粗蛋白污染的问题，获得高纯度DNA。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决现有提取沙棘DNA的方法存在DNA纯度低的问题，而提供一种适合沙棘的DNA提取方法。一种适合沙棘的DNA提取方法，它按以下步骤实现：一、取沙棘幼嫩叶片两枚置于EP管中加入蒸馏水，预冷处理，取出后自然风干并剪碎，得到剪碎的叶片；二、用液氮将研钵预冷，加PVP于研钵中，加剪碎的叶片，加液氮将叶片研磨至粉末状，然后转移至离心管中，每管0.2～0.4g，再加入预冷的去糖缓冲液和β-巯基乙醇，混合后冰上静止9-15min，离心3-4min，弃上清，收集沉淀；其中PVP和剪碎的叶片的质量比为：0.04～0.06：1；三、在上述沉淀中加入1mL65℃预热的CTAB提取缓冲液、0.1～0.2mL的2mg/mL蛋白酶K和70～90μl的硼砂，置于超声波清洗器中65℃水浴5～10min，然后常温下离心，取上清液并加入80μl的PVP，常温下离心，取上清液；四、取步骤三最终得到的上清液至离心管中，加入等体积的混合溶液，然后于37℃水浴处理30-35min，并每隔5min颠倒混匀，常温下离心，取上清液于EP管中；混合溶液：4～6mmol/L盐酸胍、10～20mmol/LTris-HCl和质量浓度20％～30％的乙醇，五、向步骤四得到的上清液中加入质量浓度20％～30％的乙醇，然后再加入Tris-酚、氯仿和异戊醇的混合液，颠倒混匀，离心，取上清液；六、向步骤五上清液中加入等体积的氯仿和异戊醇的混合液，震荡混匀后，离心，取上清液；七、向步骤六上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，混匀后于-20℃沉淀30-35min，然后4℃下离心，取沉淀，再用2倍体积的质量浓度为70％的乙醇洗涤沉淀2～3次，离心，取沉淀并自然风干；八、向风干后的沉淀中加入含RNase的TE溶液，37℃水浴处理30-35min，置于冰箱保存，即完成沙棘的DNA提取；其中步骤二中所述去糖缓冲液：3mol/LKAc，1mol/L氯化钠，0.1mol/LTris-HCl，0.02mol/LEDTA，PH8.0；步骤三中所述CTAB提取缓冲液：1.5mol/lNaCl，0.1mol/LTris-Hcl，0.02mol/LEDTA，2mol/lPVPK-90。本专利技术的优点：1、本专利技术中有效去除沙棘叶片组织中的多糖、多酚和粗蛋白，提取效果理想，所得DNA的纯度高，DNA片段完整，能满足于进一步分子生物学实验的要求，准确度更高。2、本专利技术通过研磨前预冷，去掉了部分糖类物质，在研磨加入了PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，减少了酚类、单宁类物质的影响，可以起到抗氧化作用，络合多酚和萜类物质，防止多酚类褐变而氧化，还可以去除多糖和色素，而色素是PCR的强抑制剂；去糖缓冲液去除了糖类物质，为后续提取高质量DNA打好基础；用在CTAB缓冲液中加入蛋白酶K，在加快细胞膜破裂的同时，蛋白酶K使膜蛋白降解，使与DNA结合的蛋白质降解，DNA充分游离，协同步骤四的盐酸胍去除了沙棘DNA中的粗蛋白，提高了DNA的纯度和产量，本专利技术提取的DNA的OD260/OD280值为1.87～1.92，DNA的纯度较高。3、本专利技术成本低、操作简便。本专利技术适用于提取沙棘DNA，应用于分子生物学领域。附图说明图1为实施例1提取的沙棘DNA的0.75％琼脂糖凝胶电泳检测图，其中泳道1为Maker，2-7为实施例1提取的沙棘DNA。具体实施方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一：本实施方式一种适合沙棘的DNA提取方法，它按以下步骤实现：一、取沙棘幼嫩叶片两枚置于EP管中加入蒸馏水，预冷处理，取出后自然风干并剪碎，得到剪碎的叶片；二、用液氮将研钵预冷，加PVP于研钵中，加剪碎的叶片，加液氮将叶片研磨至粉末状，然后转移至离心管中，每管0.2～0.4g，再加入预冷的去糖缓冲液和β-巯基乙醇，混合后冰上静止9-15min，离心3-4min，弃上清，收集沉淀；其中PVP和剪碎的叶片的质量比为：0.04～0.06：1；三、在上述沉淀中加入1mL65℃预热的CTAB提取缓冲液、0.1～0.2mL的2mg/mL蛋白酶K和70～90μl的硼砂，置于超声波清洗器中65℃水浴5～10min，然后常温下离心，取上清液并加入80μl的PVP，常温下离心，取上清液；四、取步骤三最终得到的上清液至离心管中，加入等体积的混合溶液，然后于37℃水浴处理30-35min，并每隔5min颠倒混匀，常温下离心，取上清液于EP管中；混合溶液：4～6mmol/L盐酸胍、10～20mmol/LTris-HCl和质量浓度20％～30％的乙醇；五、向步骤四得到的上清液中加入质量浓度20％～30％的乙醇，然后再加入Tris-酚、氯仿和异戊醇的混合液，颠倒混匀，离心，取上清液；六、向步骤五上清液中加入等体积的氯仿和异戊醇的混合液，震荡混匀后，离心，取上清液；七、向步骤六上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，混匀后于-20℃沉淀30-35min，然后4℃下离心，取沉淀，再用2倍体积的质量浓度为70％的乙醇洗涤沉淀2～3次，离心，取沉淀并自然风干；八、向风干后的沉淀中加入含RNase的TE溶液，37℃水浴处理30-35min，置于冰箱保存，即完成沙棘的DNA提取；其中步骤二中所述去糖缓冲液：3mol/LKAc，1mol/L氯化钠，0.1mol/LTris-HCl，0.02mol/LEDTA，PH8.0；步骤三中所述CTAB提取缓冲液：1.5mol/lNaCl，0.1mol/LTris-Hcl，0.02mol/LEDTA，2mol/lPVPK-90。本实施方式步骤八中DNA的溶液，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，并在E本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种适合沙棘的DNA提取方法，其特征在于它按以下步骤实现：/n一、取沙棘幼嫩叶片两枚置于EP管中加入蒸馏水，预冷处理，取出后自然风干并剪碎，得到剪碎的叶片；/n二、用液氮将研钵预冷，加PVP于研钵中，加剪碎的叶片，加液氮将叶片研磨至粉末状，然后转移至离心管中，每管0.2～0.4g，再加入预冷的去糖缓冲液和β-巯基乙醇，混合后冰上静止9-15min，离心3-4min，弃上清，收集沉淀；其中PVP和剪碎的叶片的质量比为：0.04～0.06：1；/n三、在上述沉淀中加入1mL 65℃预热的CTAB提取缓冲液、0.1～0.2mL的2mg/mL蛋白酶K和70～90μl的硼砂，置于超声波清洗器中65℃水浴5～10min，然后常温下离心，取上清液并加入80μl的PVP，常温下离心，取上清液；/n四、取步骤三最终得到的上清液至离心管中，加入等体积的混合溶液，然后于37℃水浴处理30-35min，并每隔5min颠倒混匀，常温下离心，取上清液于EP管中；混合溶液：4～6mmol/L盐酸胍、10～20mmol/LTris-HCl和质量浓度20％～30％的乙醇；/n五、向步骤四得到的上清液中加入质量浓度20％～30％的乙醇，然后再加入Tris-酚、氯仿和异戊醇的混合液，颠倒混匀，离心，取上清液；/n六、向步骤五上清液中加入等体积的氯仿和异戊醇的混合液，震荡混匀后，离心，取上清液；/n七、向步骤六上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，混匀后于-20℃沉淀30-35min，然后4℃下离心，取沉淀，再用2倍体积的质量浓度为70％的乙醇洗涤沉淀2～3次，离心，取沉淀并自然风干；/n八、向风干后的沉淀中加入含RNase的TE溶液，37℃水浴处理30-35min，置于冰箱保存，即完成沙棘的DNA提取；/n其中步骤二中所述去糖缓冲液：3mol/L KAc，1mol/L氯化钠，0.1mol/L Tris-HCl，0.02mol/L EDTA，PH8.0；/n步骤三中所述CTAB提取缓冲液：1.5mol/lNaCl，0.1mol/L Tris-Hcl，0.02mol/L EDTA，2mol/lPVPK-90。/n...

【技术特征摘要】
1.一种适合沙棘的DNA提取方法，其特征在于它按以下步骤实现：
一、取沙棘幼嫩叶片两枚置于EP管中加入蒸馏水，预冷处理，取出后自然风干并剪碎，得到剪碎的叶片；
二、用液氮将研钵预冷，加PVP于研钵中，加剪碎的叶片，加液氮将叶片研磨至粉末状，然后转移至离心管中，每管0.2～0.4g，再加入预冷的去糖缓冲液和β-巯基乙醇，混合后冰上静止9-15min，离心3-4min，弃上清，收集沉淀；其中PVP和剪碎的叶片的质量比为：0.04～0.06：1；
三、在上述沉淀中加入1mL65℃预热的CTAB提取缓冲液、0.1～0.2mL的2mg/mL蛋白酶K和70～90μl的硼砂，置于超声波清洗器中65℃水浴5～10min，然后常温下离心，取上清液并加入80μl的PVP，常温下离心，取上清液；
四、取步骤三最终得到的上清液至离心管中，加入等体积的混合溶液，然后于37℃水浴处理30-35min，并每隔5min颠倒混匀，常温下离心，取上清液于EP管中；混合溶液：4～6mmol/L盐酸胍、10～20mmol/LTris-HCl和质量浓度20％～30％的乙醇；
五、向步骤四得到的上清液中加入质量浓度20％～30％的乙醇，然后再加入Tris-酚、氯仿和异戊醇的混合液，颠倒混匀，离心，取上清液；
六、向步骤五上清液中加入等体积的氯仿和异戊醇的混合液，震荡混匀后，离心，取上清液；
七、向步骤六上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，混匀后于-20℃沉淀30-35min，然后4℃下离心，取沉淀，再用2倍体积的质量浓度为70％的乙醇洗涤沉淀2～3次，离心，取沉淀并自然风干；
八、向风干后的沉淀中加入含RNase的TE溶液，37℃水浴处理30-35min，置于冰箱保存，即完成沙棘的DNA提取；
其中步骤二中所述去糖缓冲液：3mol/LKAc，1mol/L氯化钠，0.1mol/LTris-HCl，0.02mol/LEDTA，PH8.0；
步骤三中所述CTAB提取缓冲液：1.5mol/lNaCl，0.1mol/LTris-Hcl，0.02mol/LEDTA，2mol/lPVPK-90。


2.根据权利要求1所述的一种适合沙棘的DNA提取方法，其特征在于步骤一中取沙棘幼嫩叶片两枚，置于含5mL蒸馏水的10mLEP管中，并于4℃下预处理24h。


3.根据权利要求1所述的一种适合...

【专利技术属性】
技术研发人员：王芳，李伟，吴鹏，郭茜茜，颜培玉，江新杰，张珍珠，刘林馨，王志刚，张智慧，赵金波，
申请(专利权)人：王芳，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23