本发明专利技术提供一种外周血外泌体中Notch3蛋白作为分子标记在制备遗传性脑血管疾病检测试剂盒中的应用及一种检测遗传性脑血管疾病的试剂盒。本发明专利技术研究发现人外周血提取的外泌体中Notch 3蛋白在遗传性脑血管疾病患者中显著降低。所以，外周血外泌体中Notch 3蛋白可单独或联合其他指标作为诊断遗传性脑血管疾病标记物，也可用于判断遗传性脑血管疾病患者的康复进程及康复后的复发风险。
【技术实现步骤摘要】
外周血外泌体中Notch3蛋白作为分子标记的应用及一种检测试剂盒
本专利技术涉及生物医药，具体涉及外周血外泌体中Notch3蛋白作为分子标记在制备遗传性脑血管疾病检测试剂盒中的应用及一种检测遗传性脑血管疾病的试剂盒。
技术介绍
CADASIL(cerebralautosomaldominantarteriopathywithsubcorticalinfarctsandleukoencephalopathy)即是常染色体显性遗传病合并皮质下梗死和白质脑病。伴有皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病，是一种遗传性小动脉疾病，位于19号染色体上的Notch3基因突变所致的遗传性脑小血管疾病，表现为皮质下缺血事件，并导致进行性痴呆伴假性球麻痹。CADASIL基因位于着丝点区域D19S253,端粒区域位于D19S929。CADASIL缺陷基因为Notch3基因。CADASIL患者90％发生错义突变,无突变占10％共有10种不同错义突变类型。所有突变导致半胱氨酸碱基数目发生变化。Notch3基因突变的检测为CADASIL的诊断提供了全新的方法。但现有的Notch3基因突变检测费用高、周期长，寻找价格低、周期短能早期诊断的CADASIL的新方法就显得格外重要。神经来源外泌体有其独特的神经特异表面标记物，这使得其能在循环体液中特异地检测出来。外泌体在细胞中的作用在过去几年认为的是细胞垃圾站，现在已经被证明是重要的细胞间信号分子，以及健康和疾病的重要贡献者。细胞膜内陷形成小的细胞内小泡，逐渐成熟融合形成多泡体，多泡体向内出芽形成腔内小泡。多泡体与溶酶体融合导致其内容物的裂解，与细胞膜融合导致外泌体被释放到细胞外空间。因为外泌体可以自由地穿过血脑屏障，神经元来源的外泌体可以直接反映大脑环境的变化。外泌体内容物包括核酸，蛋白质和脂质，在疾病状态下会发生变化，而且他们的膜可以保护其内容物不被降解。他们可以传播病理性蛋白质，也可以被浓缩来提高检测的敏感性。这些特征使得外泌体成为一个有价值的诊断工具。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种外周血外泌体中Notch3蛋白作为分子标记在制备遗传性脑血管疾病检测试剂盒中的应用，此为本专利技术的第一个发面。作为本专利技术的第二个方面，本专利技术还提供了一种遗传性脑血管疾病检测试剂盒，包括提取外周血外泌体的试剂以及检测Notch3蛋白的抗体。作为本专利技术的第三个方面，还提供了上述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：S1：取待检测对象的外周血样品并提取其中的外泌体；S2：提取外泌体中蛋白并利用检测Notch3蛋白的抗体对Notch3蛋白定量；S3：根据定量结果与正常样本中Notch3蛋白的量进行比较，得出待检测对象遗传性脑血管疾病进展程度。进一步的，所述步骤S1具体包括：收集待检测对象血液于EDTA抗凝管中，放置4小时后，3000×g离心1分钟，取上层血浆于2ml无菌管中，存放于-80℃冰箱待用；从-80℃取出血浆放在4℃中溶化，然后取出250μl血浆于无菌管中，3000×g离心15min去除细胞和细胞碎片，转移上清液于无菌管中，加入63μlExoQuick外泌体沉淀剂，通过颠倒，轻弹管壁混匀，放置于4℃冰箱里30min，然后1500×g离心30min，去除上清液，然后将剩余的液体重新1500×g离心5min，吸去管里所有液体，得外泌体。进一步的，所述步骤S2具体包括：将外泌体反复冻融3次后获得蛋白，通过酶联免疫吸附双抗体夹心法检测Notch3蛋白含量。与现有技术相比，本专利技术的有益效果：本专利技术研究发现人外周血提取的外泌体中Notch3蛋白在遗传性脑血管疾病患者中显著降低，相比于正常组Notch3蛋白的平均值357.5pg/ml，患者组Notch3蛋白平均值只有164.3pg/ml，显示出Notch3蛋白可单独或联合其他指标作为诊断遗传性脑血管疾病标记物，也可用于判断遗传性脑血管疾病患者的康复进程及康复后的复发风险。附图说明图1是实施例中的CADASIL患者组与健康对照组外泌体中Notch3蛋白检测结果对比。具体实施方式：实施例样本来源：所有样本均由河南省人民医院提供。病人样本来源于神经内科门诊，健康对照来自于体检中心。每一个参与者均进行神经心理评估和APOE分型测试。收集血液于EDTA抗凝管中，放置4小时后，3000×g离心1分钟，取上层血浆于2ml无菌管中，存放于-80℃冰箱待用。所有的参与者均书写知情同意。血浆外泌体提取从-80℃取出血浆放在4℃中溶化，然后取出250μl血浆于无菌管中，3000×g离心15min去除细胞和细胞碎片。转移上清液于无菌管中，加入63μlExoQuick外泌体沉淀剂，通过颠倒，轻弹管壁混匀，放置于4℃冰箱里30min，然后1500×g离心30min。离心后可以看到外泌体像一个圆饼状贴在管底。去除上清液，然后将剩余的液体重新1500×g离心5min。用枪头吸去瓶里所有液体，不要碰到瓶底的外泌体。使用酶联免疫吸附双抗体夹心法(ELISA)检测外周血中外泌体Notch3蛋白含量将外泌体反复冻融3次后获得蛋白。按照Notch3蛋白ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)的方法步骤检测Notch3蛋白含量，结果表明外泌体中Notch3蛋白在遗传性脑血管疾病患者中显著降低(图1)。检测过程具体如下：血浆神经来源的外泌体样本来自于64个参与者，包括32个CADASIL患者，32个年龄匹配的正常对照，两组参与者在性别，文化水平上无明显差异。在从血浆提取出来的外泌体中加入300μl蛋白裂解液和3μl蛋白抑制剂，然后涡旋15s，将沉淀重于溶液中。将溶液置于-80℃冰箱5min，25℃水浴锅5min，如此重复3个循环。将溶液存放于-80℃冰箱，在需要的时候拿出来溶化。从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(350μL)，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.外周血外泌体中Notch 3蛋白作为分子标记在制备遗传性脑血管疾病检测试剂盒中的应用。/n
【技术特征摘要】
1.外周血外泌体中Notch3蛋白作为分子标记在制备遗传性脑血管疾病检测试剂盒中的应用。
2.一种遗传性脑血管疾病检测试剂盒，其特征在于，包括提取外周血外泌体的试剂以及检测Notch3蛋白的抗体。
3.权利要求2所述遗传性脑血管疾病检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：取待检测对象的外周血样品并提取其中的外泌体；
S2：提取外泌体中蛋白并利用检测Notch3蛋白的抗体对Notch3蛋白定量；
S3：根据定量结果与正常样本中Notch3蛋白的量进行比较，得出待检测对象遗传性脑血管疾病进展程度。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S1具体包括：...
【专利技术属性】
技术研发人员：江海松，胡建容，王偌，
申请(专利权)人：江海松，
类型：发明
国别省市：上海;31
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