一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法及其试剂盒技术

本发明专利技术涉及黄曲霉素B1检测技术领域，公开了一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法，包括以下步骤：将黄曲霉毒素B1抗抗体与辣根过氧化物酶进行偶联得到酶标记的黄曲霉毒素B1抗抗体；用包被缓冲液将包被黄曲霉毒素B1抗原稀释，注孔，避光孵育，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤，静置，拍干，然后在孔中加入封闭液，再避光孵育，倾去孔内液体拍干，干燥后得到酶标板，用铝膜真空密封保存；建立黄曲霉毒素B1标准品浓度相对吸光度的标准曲线，并根据该标准曲线由待测样品的吸光度推算出待测样品中的黄曲霉毒素B1含量；该方法在15min内显色，检测黄曲霉毒素B1变异系数在5.3‑8.5％之间，精密度较高；并提供采用该酶联免疫检测方法进行检测的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法及其试剂盒
本专利技术涉及黄曲霉素B1检测
，具体涉及一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法及其试剂盒。
技术介绍
黄曲霉毒素B1(aflatoxinB1称AFB1)是真菌的次级代谢产物，主要是由黄曲霉(Aspergillusflavus)、寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)和特曲霉(Aspergillusnomius)产生。它易天然存在于花生、棉籽、玉米、小麦和稻米等农作物中，具有强烈的毒性和致癌性。黄曲霉毒素B1的分子式为C17H12O6，化学结构如下：其结构中含有一个双呋喃环和一个香豆素，前者为基本毒性结构，后者与其致癌性有关。黄曲霉毒素B1对雏鸭的半致死量仅为0.3mg/kg体重，其毒性为氰化钾的10倍，砒霜的68倍。当食品、饲料及其相关制品保存不当极易受到黄曲霉毒素B1的污染，黄曲霉毒素B1进入人体后，其主要靶器官为肝脏，急性中毒症状为恶心、呕吐、胃肠大出血而死亡。慢性中毒主要会引起肝癌，还可以诱发骨癌、肾癌、直肠癌等。目前，我国规定各种食物或饲料中黄曲霉毒素B1的最高允许量根据来源不同为0.5～20.0μg/Kg。国际上AFT最大允许含量不断降低，2004年欧盟再次修订对婴儿和儿童食品中AFT的限量标准，包括谷类食品在内的婴幼儿食品以及具有特殊医疗目的的婴儿食品，AFB1的最大允许限量均为0.10ug/kg。现在黄曲霉毒素B1检测方法要求也在不断提高。目前常用的方法有放射免疫分析法、荧光免疫分析法、酶联免疫分析法等。其中，放射性免疫分析虽高灵敏、高特异性，但存在有效期短、具有放射性污染的问题；荧光免疫分析法虽然特异性强、敏感性高、速度快，但非特异性染色问题尚未解决，结果判定的客观性不足，程序也比较复杂。而酶联免疫法集合了抗原抗体反应的高特异性与酶促反应的高度敏感性。这种方法灵敏度高，比薄层法提高了近200倍；特异性强，荧光物质、色素、结构类似物对结果无干扰；而且回收率高，提取方法简单，可进行定性定量测定。但目前黄曲霉毒素B1的酶联免疫分析方法精密度较低。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法，该方法在15min内显色，检测黄曲霉毒素B1变异系数在5.3-8.5％之间，精密度较高，且测得黄曲霉毒素B2/G1/G2交叉反应率结果均小于1％；并提供采用该酶联免疫检测方法进行检测的试剂盒。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法，包括以下步骤：(1)以黄曲霉毒素B1单克隆抗体为免疫原对无病原体免疫动物进行免疫，得到黄曲霉毒素B1抗抗体；(2)将步骤(1)得到的黄曲霉毒素B1抗抗体与辣根过氧化物酶进行偶联得到酶标记的黄曲霉毒素B1抗抗体；(3)用包被缓冲液将包被黄曲霉毒素B1抗原稀释，注孔，避光孵育，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤，静置，拍干，然后在孔中加入封闭液，再避光孵育，倾去孔内液体拍干，干燥后得到酶标板，用铝膜真空密封保存；(4)建立黄曲霉毒素B1标准品浓度相对吸光度的标准曲线，并根据该标准曲线由待测样品的吸光度推算出待测样品中的黄曲霉毒素B1含量。在本专利技术中，优选的，所述免疫动物为山羊。在本专利技术中，优选的，所述黄曲霉毒素B1单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：将包被黄曲霉毒素B1抗原注入到Balb/c小鼠体内，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔；利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌黄曲霉毒素B1单克隆抗体的杂交瘤细胞株；注射细胞进小鼠体内诱生腹水；将采集的腹水用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。在本专利技术中，优选的，所述包被黄曲霉毒素B1抗原的制备方法，包括以下步骤：1)将黄曲霉素B1和羧甲基羟半盐酸盐溶于吡啶甲醇混合溶液中，搅拌，旋干，加入双蒸水溶解，随即用碳酸氢钠调节pH至8.0，苯酚萃取，再用硫酸调节液相pH至4.0，在氮气保护下浓缩，得到黄色油状液体即为AFB1肟化物黄曲霉毒素B1抗原；2)将得到的AFB1肟化物黄曲霉毒素B1抗原溶于DMF中，加入碳二亚胺盐酸盐，搅拌，取BSA溶解于LPBS缓冲液中，将此溶液加入反应液中，相同条件继续反应，离心后用PBS透析，得到免疫黄曲霉毒素B1抗原；3)将免疫黄曲霉毒素B1抗原、N羟基琥珀亚胺和二环己基碳二亚胺溶解于无水四氢呋喃中震荡反应，离心，取上清吹干，加入DMF；取OVA溶解于PBS缓冲液中，加入到反应物中反应，离心后用PBS透析，得到包被黄曲霉毒素B1抗原。在本专利技术中，优选的，所述包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐溶液。在本专利技术中，优选的，在步骤(3)中，用pH9.6碳酸盐将包被黄曲霉毒素B1抗原稀释成5μg/mL。在本专利技术中，优选的，在步骤(3)中，每孔加入150μl稀释后的包被黄曲霉毒素B1抗原稀释液，4℃避光孵育16h，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤1次，静置30s，拍干，然后在每孔中加入200μl封闭液，37℃避光孵育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存.在本专利技术中，优选的，建立黄曲霉毒素B1标准品标准曲线时选用的底物显色液由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺。在本专利技术中，优选的，终止液为2mol/L硫酸；洗涤液为含有0.01％吐温-20、3g/L叠氮化钠防腐剂、0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，pH为7.2；复溶液为0.02mol/L的磷酸盐缓冲液，pH值为7.0。一种检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫检测试剂盒，采用上述检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫检测方法。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术酶联免疫检测方法在15min内显色，检测黄曲霉毒素B1变异系数在5.3-8.5％之间，精密度较高，且测得黄曲霉毒素B2/G1/G2交叉反应率结果均小于1％；同时，本试剂盒制备方法简单，可以在2～8℃至少保存12个月以上，37℃加速老化保存21天或-20℃冰箱冷冻7天，其各项指标完全正常。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。1、黄曲霉毒素B1抗原制备(1)人工抗原制备：2mg黄曲霉素B1(以下简称为AFB1)和4mg羧甲基羟半盐酸盐溶于2ml吡啶甲醇混合溶液(0.5ml吡啶:1.5ml甲醇)中，于25℃搅拌24h，用旋转蒸发仪蒸干，加入2ml双蒸水溶解，随即用0.2mol/L碳酸氢钠调节pH至8.0，用苯酚萃取3次，每次2ml萃取未肟化的AFB1，再用0.2mol/L的硫酸调节液相pH至4.0，用乙酸乙酯分3次，每次1ml，在氮气保护下浓缩，得到黄色油状液体即为AFB1肟化物黄曲本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)以黄曲霉毒素B1单克隆抗体为免疫原对无病原体免疫动物进行免疫，得到黄曲霉毒素B1抗抗体；/n(2)将步骤(1)得到的黄曲霉毒素B1抗抗体与辣根过氧化物酶进行偶联得到酶标记的黄曲霉毒素B1抗抗体；/n(3)用包被缓冲液将包被黄曲霉毒素B1抗原稀释，注孔，避光孵育，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤，静置，拍干，然后在孔中加入封闭液，再避光孵育，倾去孔内液体拍干，干燥后得到酶标板，用铝膜真空密封保存；/n(4)建立黄曲霉毒素B1标准品浓度相对吸光度的标准曲线，并根据该标准曲线由待测样品的吸光度推算出待测样品中的黄曲霉毒素B1含量。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以黄曲霉毒素B1单克隆抗体为免疫原对无病原体免疫动物进行免疫，得到黄曲霉毒素B1抗抗体；
(2)将步骤(1)得到的黄曲霉毒素B1抗抗体与辣根过氧化物酶进行偶联得到酶标记的黄曲霉毒素B1抗抗体；
(3)用包被缓冲液将包被黄曲霉毒素B1抗原稀释，注孔，避光孵育，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤，静置，拍干，然后在孔中加入封闭液，再避光孵育，倾去孔内液体拍干，干燥后得到酶标板，用铝膜真空密封保存；
(4)建立黄曲霉毒素B1标准品浓度相对吸光度的标准曲线，并根据该标准曲线由待测样品的吸光度推算出待测样品中的黄曲霉毒素B1含量。


2.根据权利要求1所述的一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法，其特征在于，所述免疫动物为山羊。


3.根据权利要求1所述的一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法，其特征在于，所述黄曲霉毒素B1单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：将包被黄曲霉毒素B1抗原注入到Balb/c小鼠体内，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔；利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌黄曲霉毒素B1单克隆抗体的杂交瘤细胞株；注射细胞进小鼠体内诱生腹水；将采集的腹水用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。


4.根据权利要求2所述的一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法，其特征在于，所述包被黄曲霉毒素B1抗原的制备方法，包括以下步骤：
1)将黄曲霉素B1和羧甲基羟半盐酸盐溶于吡啶甲醇混合溶液中，搅拌，旋干，加入双蒸水溶解，随即用碳酸氢钠调节pH至8.0，苯酚萃取，再用硫酸调节液相pH至4.0，在氮气保护下浓缩，得到黄色油状液体即为AFB1肟化物黄曲霉毒素B1抗原；
2)将得到的AFB1肟化物黄曲霉毒素B1抗原溶于DMF中，加入碳二...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙惠洁，于兴华，张丽丽，翁正杭，杨鸿乐，李欣，
申请(专利权)人：信达安检测技术天津有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12