本发明专利技术公开了一种用于检测血清中胱抑素C含量的试剂盒及其制备方法。本发明专利技术提供的试剂盒，包括R1试剂和R2试剂；R1试剂中，含有Procline‑300 1g/L、吐温‑20 7.5g/L、PEG‑6000 30g/L、乙二胺四乙酸二钠6.98g/L，余量为pH8.0、20mM的甘氨酸‑氢氧化钠缓冲液；R2试剂是通过如下方法制备得到的：取含有抗胱抑素C多克隆抗体包被的胶乳颗粒的液相，加入procline‑300和BSA，使procline‑300的浓度为1g/L、BSA的浓度为2g/L。本发明专利技术提供的试剂盒基于胶乳增强免疫比浊法检测胱抑素C，具有操作简单、快速、特异性好、灵敏度高、准确性好和线性范围宽的优点，可适用于自动化分析仪并且便于生产，适合于临床样本批量检测。
【技术实现步骤摘要】
一种用于检测血清中胱抑素C含量的试剂盒及其制备方法
本专利技术涉及一种用于检测血清中胱抑素C含量的试剂盒及其制备方法，具体涉及一种基于胶乳增强免疫比浊法检测血清中胱抑素C含量的试剂盒及其制备方法。
技术介绍
胱抑素C(CystatinC，CysC)是一种用于评价早期肾功能损伤的特异性高、准确性好且较为敏感的新指标，是反映肾小球滤过率(GFR)变化的理想标志物。胱抑素C，又称为γ2痕迹碱性蛋白或后γ球蛋白，是半胱氨酸蛋白酶抑制剂中的一种，是半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族2中的成员之一，相对分子量为13.3KD，由122个氨基酸残基组成，可由机体内所有有核细胞产生，产生率恒定。1985年Simonsen等人发现胱抑素C可作为反映肾小球滤过率，且不受年龄、性别等其他因素的影响，是一种优良的内源性标志物。此外，胱抑素C也是心脑血管疾病、糖尿病肾病和先兆子痫的优良诊断标志物。胱抑素C的正常参考范围为0.6-1.03mg/L。目前已知的胱抑素C测定方法有放射免疫法(RIA)、化学发光法、酶联免疫吸附法(ELISA)法等。放射免疫分析法步骤繁琐，试剂价格昂贵，需使用配套的仪器且存在放射性污染。酶联免疫吸附法存在检测时间长、操作复杂、重复性差、不适于急诊和临床病人及时诊断的需要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测血清中胱抑素C含量的试剂盒及其制备方法。本专利技术提供了一种制备抗胱抑素C多克隆抗体包被的胶乳颗粒的方法(简称方法甲)，包括如下步骤：(1)25mlMES缓冲液与25ml胶乳微球混合，然后加入4.3ml1％TritonX-100溶液，然后30℃反应15分钟(反应条件具体可为80rpm振荡)；(2)向完成步骤(1)的体系中加入2.5ml100mg/mlNHS水溶液并混匀，2min后加入2.5ml50mg/mlEDC水溶液，然后30℃反应30分钟(反应条件具体可为80rpm振荡)；(3)向完成步骤(2)的体系中加入125ml硼酸盐缓冲液，然后30℃反应3分钟(反应条件具体可为300rpm振荡)；(4)向完成步骤(3)的体系中加入25mlCysC多克隆抗体溶液，然后30℃反应3小时(反应条件具体可为90rpm振荡)；(5)向完成步骤(4)的体系中加入25ml封闭液，然后30℃反应40分钟(反应条件具体可为90rpm振荡)；(6)完成步骤(5)后，用硼酸盐缓冲液定容至500ml，然后30℃反应15分钟(反应条件具体可为90rpm振荡)。所述方法还包括如下步骤：(7)完成步骤(6)后，置于37℃环境中孵育8-12小时(具体可为10小时)，得到含有抗胱抑素C多克隆抗体包被的胶乳颗粒的液相，简称多抗胶乳微球液相。方法甲中，胶乳微球和CysC多克隆抗体的原料配比为50mg：1.5mg。多抗胶乳微球液相中，胶乳微球的浓度为2.5mg/ml，CysC多克隆抗体的浓度为0.075mg/ml(均以原料加入量计)。将方法甲命名为稳态一步法。稳态一步法：整个反应过程都在均匀的胶体溶液环境中进行的交联方法称为稳态一步法。采用方法甲制备包被胱抑素C抗体的乳胶颗粒，简化了操作步骤，解决了胶乳分散问题，并提升了性能与稳定性。胶乳微球的粒径为60-300nm，具体可为100-300nm。胶乳微球的粒径为107nm。胶乳微球具体为JSRLifeSciences公司的货号为P0115的产品，粒径为107nm，产品形式为液态，其中胶乳微球含量为50mg/ml。CysC多克隆抗体溶液：取CysC多克隆抗体，用硼酸盐缓冲液稀释至1.5mg/ml。CysC多克隆抗体：北京晶华生物技术有限公司，兔抗人CYSc抗体，产品形式为液态，其中抗体浓度为10mg/ml。MES缓冲液为pH6.0、0.2mol/L的MES缓冲液。1％TritonX-100溶液的制备方法：将1gTritonX-100溶于100ml水。硼酸盐缓冲液(BBS)的制备方法：取硼酸2.23g、十水合四硼酸钠1.72g，溶于800ml水，调pH至8.3-8.5，用水定容至1L。封闭液：100g/LBSA水溶液。本专利技术还保护一种制备检测血液样本中的胱抑素C含量的试剂盒的方法(简称方法乙)，包括如下步骤：(1)采用方法甲制备含有抗胱抑素C多克隆抗体包被的胶乳颗粒的液相；(2)制备R1试剂和R2试剂；R1试剂中，含有Procline-3001g/L、吐温-207.5g/L、PEG-600030g/L、乙二胺四乙酸二钠6.98g/L，余量为pH8.0、20mM的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液；R2试剂的制备方法：取步骤(1)制备的含有抗胱抑素C多克隆抗体包被的胶乳颗粒的液相，加入procline-300和BSA，使procline-300的浓度为1g/L、BSA的浓度为2g/L。所述方法乙还包括如下步骤：制备标准品溶液。标准品溶液：含胱抑素C20mg/L、Procline-3001g/L、吐温-207.5g/L、PEG-600030g/L、乙二胺四乙酸二钠6.98g/L，余量为pH8.0、20mM的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。检测血液样本中的胱抑素C含量的试剂盒由分别独立包装的R1试剂和R2试剂组成。检测血液样本中的胱抑素C含量的试剂盒由分别独立包装的R1试剂、R2试剂和标准品溶液组成。本专利技术还保护方法乙制备得到的试剂盒。本专利技术还保护方法甲在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒为检测血液样本中的胱抑素C含量的试剂盒。本专利技术还保护方法甲制备得到的抗胱抑素C多克隆抗体包被的胶乳颗粒。本专利技术还保护一种检测血液样本中的胱抑素C含量的试剂盒，包括R1试剂和R2试剂；R1试剂中，含有Procline-3001g/L、吐温-207.5g/L、PEG-600030g/L、乙二胺四乙酸二钠6.98g/L，余量为pH8.0、20mM的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液；R2试剂是通过如下方法制备得到的：取方法甲制备得到的含有抗胱抑素C多克隆抗体包被的胶乳颗粒的液相，加入procline-300和BSA，使procline-300的浓度为1g/L、BSA的浓度为2g/L。所述试剂盒还包括标准品溶液。标准品溶液：含胱抑素C20mg/L、Procline-3001g/L、吐温-207.5g/L、PEG-600030g/L、乙二胺四乙酸二钠6.98g/L，余量为pH8.0、20mM的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。R1试剂的功能：提供反应环境、控制反应达到终点的时间和速率，保证功能组分的稳定性和反应活性，使抗原位点充分暴露(从而有利于抗原与CysC多克隆抗体充分结合)。R1试剂为液态试剂。R2试剂的功能：特异性识别并结合血清中的胱抑素C抗原。R2试剂为液态，呈现均一乳白色。R2试剂稳定性好，在2-8度可以保存12个月。以上任一所述试剂盒中，R1试剂和R2试剂均独立包装。以本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种制备抗胱抑素C多克隆抗体包被的胶乳颗粒的方法，包括如下步骤：/n(1)25ml MES缓冲液与25ml胶乳微球混合，然后加入4.3ml 1％Triton X-100溶液，然后30℃反应15分钟；/n(2)向完成步骤(1)的体系中加入2.5ml 100mg/ml NHS水溶液并混匀，2min后加入2.5ml 50mg/ml EDC水溶液，然后30℃反应30分钟；/n(3)向完成步骤(2)的体系中加入125ml硼酸盐缓冲液，然后30℃反应3分钟；/n(4)向完成步骤(3)的体系中加入25ml CysC多克隆抗体溶液，然后30℃反应3小时；/n(5)向完成步骤(4)的体系中加入25ml封闭液，然后30℃反应40分钟；/n(6)完成步骤(5)后，用硼酸盐缓冲液定容至500ml，然后30℃反应15分钟。/n
【技术特征摘要】
1.一种制备抗胱抑素C多克隆抗体包被的胶乳颗粒的方法，包括如下步骤：
(1)25mlMES缓冲液与25ml胶乳微球混合，然后加入4.3ml1％TritonX-100溶液，然后30℃反应15分钟；
(2)向完成步骤(1)的体系中加入2.5ml100mg/mlNHS水溶液并混匀，2min后加入2.5ml50mg/mlEDC水溶液，然后30℃反应30分钟；
(3)向完成步骤(2)的体系中加入125ml硼酸盐缓冲液，然后30℃反应3分钟；
(4)向完成步骤(3)的体系中加入25mlCysC多克隆抗体溶液，然后30℃反应3小时；
(5)向完成步骤(4)的体系中加入25ml封闭液，然后30℃反应40分钟；
(6)完成步骤(5)后，用硼酸盐缓冲液定容至500ml，然后30℃反应15分钟。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
胶乳微球和CysC多克隆抗体的原料配比为50mg：1.5mg。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述方法还包括如下步骤：
(7)完成步骤(6)后，置于37℃环境中孵育8-12小时，得到含有抗胱抑素C多克隆抗体包被的胶乳颗粒的液相，简称多抗胶乳微球液相。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：多抗胶乳微球液相中，胶乳微球的浓度为2.5mg/ml，CysC多克隆抗体的浓度为0.075mg/ml。
5.一种制备检测血液样本中的胱抑素C含量的试剂盒的方法，包括如下步骤：
(1)采用权利要求3或4所述方法制备多抗胶乳微球液相；
(2)制备R1试剂和R2试剂；
...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘小云，
申请(专利权)人：武汉市长立生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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