通过外周血循环肿瘤细胞检测结直肠癌患者PD-L1基因表达的免疫荧光试剂盒制造技术

本发明专利技术提供通过外周血循环肿瘤细胞检测结直肠癌患者PD‑L1基因表达的免疫荧光试剂盒，属于分子生物学领域，具体的，试剂盒主要包括：山羊血清，小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗PD‑L1基因组成的一抗混悬液，荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔组成的二抗混悬液。检测方法主要包括采集外周血，处理外周血，过滤富集循环肿瘤细胞，免疫荧光方法检测循环肿瘤细胞PD‑L1基因表达情况。

【技术实现步骤摘要】
通过外周血循环肿瘤细胞检测结直肠癌患者PD-L1基因表达的免疫荧光试剂盒
本专利技术提供了一种结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1基因表达的免疫荧光试剂盒及检测方法，属于分子生物学

技术介绍
结直肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，2018年死亡率居恶性肿瘤第四位。在美国，结直肠癌是第三大最常见的恶性肿瘤。在国内，2018年中国全年流行病学数据：结直肠癌的发病率和死亡率均为第5位，年新发病例37.63万，25％被确诊时已发生转移。结直肠癌早期多无症状，出现症状时多为中晚期且有转移。尽管外科手术和化疗方案不断革新，进展期结直肠癌患者的生存率依旧很差。由于结直肠癌尚缺乏较好的预防方法，所以改善结直肠癌预后并提高生存率的最有效的措施就是早期诊断并治疗结直肠早期癌及癌前病变。以PD-1/PD-L1为免疫靶点的免疫疗法为结直肠癌治疗带来了新的曙光。研究发现，免疫抑制与免疫逃逸和肿瘤细胞PD-L1的过表达密切相关，肿瘤细胞可通过其表面的PD-L1与免疫细胞T细胞表面的PD-1结合，传导抑制性信号，使得T细胞不能识别肿瘤细胞和向肿瘤细胞发出攻击信号，导致了肿瘤细胞免疫逃逸。基于此理论提出假设，自原发灶脱落进入循环系统的循环肿瘤细胞(CTC)出现凋亡、免疫清除或存活、转移结局与PD-L1表达密切相关。PD-1或PD-L1免疫制剂的疗效多与肿瘤组织中PD-L1的免疫组化表达水平有关，提示PD-L1表达水平可能是预测PD-1免疫治疗疗效的生物标志物；目前结直肠癌循环肿瘤细胞PD-L1的检测国内外均未见报道。因此，检测循环肿瘤细胞(CTC)PD-L1表达情况对结直肠癌预后及免疫治疗疗效评估具有重要价值。循环肿瘤细胞（Circulatingtumorcell，CTC）是从实体肿瘤脱落进入外周血液循环的肿瘤细胞，自1989年被发现以来，目前已有多种方法用于外周血循环肿瘤细胞的检测。近期研究表明，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的个体化治疗具有重要的临床意义。因CTC检测具有微创、实时检测等特点，被称为肿瘤的“液态活检”。免疫荧光分析技术即将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来用以研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发出的荧光可在荧光显微镜下检出，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或橘红色)，可以看见荧光所在的细胞或组织，利用定量技术测定含量，从而对抗原进行细胞定性和定位分析。针对目前临床实践中，结直肠癌患者PD-L1基因检测的标本主要为肿瘤组织，来源于手术或穿刺活检，很难做到多次或实时检测。因此，检测循环肿瘤细胞(CTC)PD-L1基因表达情况对结直肠癌预后及免疫治疗疗效评估具有重要价值。目前，山东省第一医科大学、山东省药物研究院联合山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司等单位，对于循环肿瘤细胞检测鉴定关键技术进行产业化推广的研究，本项目为山东省重大科技创新工程项目，本项目将以山东第一医科大学济南校区的山东省药物研究院为核心，落实注册人制度，依托循环肿瘤细胞检测鉴定核心诊断技术，进一步注册鉴定诊断试剂盒，以包括PD1、PD-L1、ER、PR、Her-2、GPC-3、VEGF、P53、Vimentin、TKI-EGFR、RAS、CK、ALK-D5F3、CD20、ALK/EML4、Beta-catenin、E-Cadherin、EP-CAM、HPV、IDH-1、PSA、PSMA、VEGF、GFAP、细胞角蛋白、AE1/AE3、雌激素受体、孕激素受体、BCA-225、CA125、CEA、EMA、ERCC1、HPV、Ki-67、P53、TOP2A等作为CTCs表达的示踪剂，注册超灵敏、超快速、高覆盖、低成本、准确特异的鉴定诊断试剂盒，通过与在济南注册的山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司合作进行产业化推广。
技术实现思路
针对现有技术中的检测肿瘤晚期或复发结直肠癌患者无法实时或反复穿刺获取组织标本、进而不能评估患者PD-L1基因实时动态状态，及现有检测方法容易出现假阳性和假阴性的缺点，本专利技术提供了一种结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1基因表达的免疫荧光试剂盒及检测方法，利用膜过滤装置分离获得晚期结直肠癌患者外周血中的循环肿瘤细胞（CTC），进一步运用免疫荧光技术检测CTC上PD-L1基因表达情况。本专利技术通过以下技术方案实现：一种检测结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1基因表达的免疫荧光试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL，脱色液1mL，染色液A0.5mL，染色液B1mL，200μl甲醇、200μl2%PFA，100μl10%山羊血清，小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗PD-L1基因组成的一抗混悬液100μl，荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔组成的二抗混悬液100μL，DAPI封片剂；一抗混悬液中小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗PD-L1基因分别按1:100、1:400和1:500稀释，总体积为100μL；二抗混悬液中荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔按1:500稀释。其中，所述稀释液是由1mmol/LEDTA+1mmol月硅酸盐+0.1%BSA+0.2%泊洛沙姆组成。其中，所述脱色液是由95%酒精与100%二甲苯按体积比1:1组成。其中，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。上述的试剂盒非诊断目的检测结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1基因表达的方法，包括以下步骤：（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发结直肠癌患者外周血：采集无法获取组织标本的晚期或复发结直肠癌患者肘正中静脉外周血5ml；（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液进行10倍稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；（3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血CTC：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；（4）过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器，将循环肿瘤细胞染色液A液0.5ml加入到滤器中，染色3min，PBS缓冲液冲洗干净；滤液过滤完全后加入染色液B液1ml，染色2min，纯水1ml冲洗2次；（5）向滤器中加入200μl2%PFA，室温固定5min，完成后0.5mlPBS漂洗3次，每次2min；（6）再向滤器中加入200μl预冷的甲醇，4℃固定15min，取下滤膜，放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC；（7）运用免疫荧光方法检测外周血CTC的PD-L1基因表达情况。其中，所述的步骤（7）运用免疫荧光方法检测外周血CTC的PD-L1基因表达的具体方法如下：（1）脱色：将带有CTC的滤膜从载玻片上取下，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1基因表达的免疫荧光试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL，脱色液1mL，染色液A 0.5mL，染色液B 1mL，200μl 甲醇、200μl2%PFA，100μl10%山羊血清，小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗PD-L1基因组成的一抗混悬液100μl，荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔组成的二抗混悬液100μL，DAPI封片剂；/n一抗混悬液中小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗PD-L1基因分别按1:100、1:400和1:500稀释，总体积为100μL；/n二抗混悬液中荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔按1:500稀释。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1基因表达的免疫荧光试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL，脱色液1mL，染色液A0.5mL，染色液B1mL，200μl甲醇、200μl2%PFA，100μl10%山羊血清，小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗PD-L1基因组成的一抗混悬液100μl，荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔组成的二抗混悬液100μL，DAPI封片剂；
一抗混悬液中小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗PD-L1基因分别按1:100、1:400和1:500稀释，总体积为100μL；
二抗混悬液中荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔按1:500稀释。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液是由1mmol/LEDTA+1mmol月硅酸盐+0.1%BSA+0.2%泊洛沙姆组成。


3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述脱色液是由95%酒精与100%二甲苯按体积比1:1组成。


4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。


5.一种利用权利要求1-4任一项所述的试剂盒非诊断目的检测结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1基因表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发结直肠癌患者外周血：采集无法获取组织标本的晚期或复发结直肠癌患者肘正中静脉外周血5ml；
（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液进行10倍稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；
（3）利用膜过...

【专利技术属性】
技术研发人员：李浩，李胜，夏梅，刘智鸿，
申请(专利权)人：山东第一医科大学山东省医学科学院，
类型：发明
国别省市：山东;37