一种检测肾癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1基因突变的试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提供了一种检测肾癌患者外周血循环肿瘤细胞PD‑L1基因突变的试剂盒及检测方法，属于分子生物学技术领域。该试剂盒包括稀释液、脱色液、染色液A、染色液B、PD‑L1（人）一抗、山羊抗人IgG/HRP、0.1%Triton X‑100、0.3%H

【技术实现步骤摘要】
一种检测肾癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1基因突变的试剂盒及检测方法
本专利技术属于分子生物学
，尤其涉及一种检测肾癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1基因突变的试剂盒及检测方法。
技术介绍
肾细胞癌(renalcellcarcinoma，RCC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率约占全身恶性肿瘤的2-3％，近几十年其发病呈上升趋势。根治性手术是治疗肾癌的有效手段，但约有20％～30％的肾癌患者就诊时已出现远处转移。即使经历肾癌根治手术，仍有20％～40％的患者会出现复发、转移。随着靶向药物的临床应用，晚期肾癌患者的生存期已经大大延长，但对高危转移性肾癌患者，单纯靶向治疗效果仍不理想，5年生存率不足10％。近年来，以PD-1/PD-L1为靶点的免疫疗法为肾细胞癌治疗带来了新的曙光。研究发现，免疫抑制及免疫逃逸与肿瘤细胞PD-L1的过表达密切相关，肿瘤细胞可通过其表面的PD-L1与免疫细胞T细胞表面的PD-1结合，传导抑制性信号，使得T细胞不能识别、攻击肿瘤细胞，导致肿瘤细胞发生免疫逃逸。基于此理论提出假设，自原发灶脱落进入循环系统的循环肿瘤细胞(CTC)发生凋亡、免疫清除或存活、转移结局与其PD-L1表达水平密切相关。既往研究结果证实，PD-1或PD-L1免疫制剂的疗效多与肿瘤组织中PD-L1的表达水平有关，提示PD-L1可能是预测免疫治疗疗效的生物标志物，此外，还有研究表明肾细胞癌组织中PD-L1的高表达与肿瘤侵袭性呈正相关。因此，检测循环肿瘤细胞(CTC)PD-L1表达情况对肾细胞癌预后判断及免疫治疗疗效评估具有重要价值。目前，山东省第一医科大学、山东省药物研究院联合山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司等单位，对于循环肿瘤细胞检测鉴定关键技术进行产业化推广的研究，本项目为山东省重大科技创新工程项目，本项目将以山东第一医科大学济南校区的山东省药物研究院为核心，落实注册人制度，依托循环肿瘤细胞检测鉴定核心诊断技术，进一步注册鉴定诊断试剂盒，以包括PD1、PD-L1、ER、PR、Her-2、GPC-3、VEGF、P53、Vimentin、TKI-EGFR、RAS、CK、ALK-D5F3、CD20、ALK/EML4、Beta-catenin、E-Cadherin、EP-CAM、HPV、IDH-1、PSA、PSMA、VEGF、GFAP、细胞角蛋白、AE1/AE3、雌激素受体、孕激素受体、BCA-225、CA125、CEA、EMA、ERCC1、HPV、Ki-67、P53、TOP2A等作为CTCs表达的示踪剂，注册超灵敏、超快速、高覆盖、低成本、准确特异的鉴定诊断试剂盒，通过与在济南注册的山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司合作进行产业化推广。
技术实现思路
为了克服晚期或复发肾癌患者无法实时或反复穿刺获取组织标本、进而不能评估患者PD-L1状态的不足，本专利技术提供了一种肾癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1基因突变非诊断目的的检测方法：利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚期或复发非肾癌患者外周血中的CTC，进一步运用免疫组化技术检测CTC的PD-L1表达情况。本专利技术采用的技术方案如下：一种检测肾癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1基因突变的试剂盒，包括稀释液50mL、脱色液1mL、染色液A0.5mL、染色液B1mL、PD-L1（人）一抗100μL、山羊抗人IgG/HRP100μL、0.1%TritonX-100100μL、0.3%H2O2100μL、6×PBS缓冲液60mL。进一步地,所述稀释液是由1mmol/LEDTA+0.1%BSA+0.1%海藻糖+0.2%月桂醇聚氧乙烯醚组成。进一步地，所述脱色液是由95%酒精与100%二甲苯按容积比1:1组成。进一步地，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。一种上述的试剂盒非诊断目的检测肾癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1基因突变的方法，包括以下步骤：（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发肾癌患者外周血中的CTC：采集无法获取组织标本的晚期或复发肾癌患外周血：肘正中静脉外周血5ml；（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液进行10倍稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；（3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血CTC：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；（4）过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器，将循环肿瘤细胞染色液A液0.5ml加入到滤器中，染色3min，PBS缓冲液冲洗干净；滤液过滤完全后加入染色液B液1ml，染色2min，纯水1ml冲洗2次，取下滤膜，放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC；（5）运用免疫组化技术检测CTC的PD-L1表达情况。本专利技术检测CTC的PD-L1表达的具体方法如下：（1）脱色：将带有CTC的滤膜从载玻片上取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液；（2）滴加100μl0.1%TritonX-100，室温孵育15min，DI水洗2min×3次；（3）滴加100μl0.3%H2O2，室温孵育10min，PBS洗2min×3次；（4）滴加100μlPD-L1（人）一抗，室温孵育2h或4℃过夜，PBS洗2min×3次；（5）滴加100μl山羊抗人IgG/HRP，18～26℃温度下孵育20min，PBS洗2min×3次；（6）滴加100μlDAB显色液，18～26℃孵育并随时在显微镜下观察显色情况，观察时间为3～10min；（7）显色完成后，弃掉DAB显色液，流水冲洗5min，苏木素染色5min；（8）盐酸酒精分化8秒，自来水返蓝5min；（9）将返蓝后的CTC采用75%乙醇（1min），95%乙醇（1min），100%乙醇（1min）梯度乙醇脱水，然后加入0.5mL试剂A，振荡均匀后，加入1mL试剂B，摇动混合均匀后，离心沉淀，将沉淀物采用中性树脂封固；（10）光学显微镜下镜检。本专利技术所使用的膜过滤分离肿瘤细胞装置，包括滤器、血样容器、废液缸和铁架台，所述铁架台设有底座、立架和支架，所述血样容器通过支架设置于铁架台上部，血样容器的下方为滤器，滤器通过输液器联通至废液缸，废液缸设置于底座上。所述滤器包括滤器上口、滤膜、载滤膜平台和滤器下口，滤膜置于载滤膜平台上；滤器上口接血样容器，滤器下口通过输液器接废液缸。所述滤膜为疏水材料制成，其上均匀布满口径为8微米的滤孔。本专利技术的有益效果是：（1）本专利技术提供的检测方法，不用穿刺活检获取组织标本即可检测到晚期或复发肾癌患者PD-L1表达情况。该技术属于微创，并能够实时检测。（2）本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测肾癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1基因突变的试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A 0.5mL、染色液B 1mL、PD-L1（人）一抗100μL、山羊抗人IgG/HRP 100μL、0.1% Triton X-100 100μL、0.3% H

【技术特征摘要】
1.一种检测肾癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1基因突变的试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A0.5mL、染色液B1mL、PD-L1（人）一抗100μL、山羊抗人IgG/HRP100μL、0.1%TritonX-100100μL、0.3%H2O2100μL、6×PBS缓冲液60mL,所述PBS缓冲液的pH值为7.6。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液是由1mmol/LEDTA+0.1%BSA+0.1%海藻糖+0.2%月桂醇聚氧乙烯醚组成。


3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述脱色液是由95%酒精与100%二甲苯按容积比1:1组成。


4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。


5.一种利用权利要求1-4任一项所述的试剂盒非诊断目的检测肾癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发肾癌患者外周血中的CTC：采集无法获取组织标本的晚期或复发肾癌患外周血：肘正中静脉外周血5ml；
（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液进行10倍稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；
（3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血CTC：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；
（4）过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹本奎，李胜，李浩，刘智鸿，于冰，
申请(专利权)人：山东第一医科大学山东省医学科学院，
类型：发明
国别省市：山东;37