一种检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞CA199表达的免疫荧光试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及一种检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞CA199表达的免疫荧光试剂盒及检测方法，属于分子生物学技术领域。本发明专利技术提供了一种检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞CA199表达的免疫荧光试剂盒及检测方法，利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚期或复发胰腺癌患者外周血中的CTC，进一步运用免疫荧光技术检测CTC的CA199表达情况。本发明专利技术提供的检测方法，不用穿刺活检获取组织标本即可检测到晚期或复发胰腺癌患者CA199表达情况。该技术属于微创，并能够实时检测。同时能够避免染色过程中可能产生的边缘效应导致的假阳性结果，稳定性好，降低细胞的损失，提高检测的准确性。

【技术实现步骤摘要】
一种检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞CA199表达的免疫荧光试剂盒及检测方法
本专利技术涉及一种检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞CA199表达的免疫荧光试剂盒及检测方法，属于分子生物学

技术介绍
胰腺癌是消化系统常见的恶性肿瘤，也是预后最差的恶性肿瘤之一，在恶性肿瘤所导致的死亡中，胰腺癌排第四位，90％患者在确诊后一年内死亡，5年生存率不足5％。由于胰腺癌早期症状隐匿，且没有特异性，侵袭性强，转移早，确诊时多处于中晚期，手术切除率低，确诊时候仅15％，因此对胰腺癌患者治疗方法的选定显得尤为重要，可以使部分患者避免不必要的手术创伤及风险。CAl99(carbohydrateantigenl99)又称肿瘤相关199抗原、胃肠癌相关抗原或糖抗原，是一种黏蛋白类肿瘤标记物，系细胞膜上的糖脂质，在血液中以黏蛋白的形式存在。CAl99是一种与腺癌高度相关的抗原物质，由腺癌细胞产生，经胸导管引流入血。血清CAl99正常参考值为39kU／L，恶性肿瘤血清中CAl99浓度多明显升高，尤其是胰腺癌、结肠癌患者，升高几倍至几十倍不等，甚至可达1000U／mL，故主要用于胰腺癌的早期诊断，而目前临床实践中，胰腺癌患者CA199检测的标本主要为肿瘤组织，来源于手术或穿刺活检，很难做到多次或实时检测。目前，山东省第一医科大学、山东省药物研究院联合山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司等单位，对于循环肿瘤细胞检测鉴定关键技术进行产业化推广的研究，本项目为山东省重大科技创新工程项目，本项目将以山东第一医科大学济南校区的山东省药物研究院为核心，落实注册人制度，依托循环肿瘤细胞检测鉴定核心诊断技术，进一步注册鉴定诊断试剂盒，以包括PD1、PD-L1、ER、PR、Her-2、GPC-3、VEGF、P53、Vimentin、TKI-EGFR、RAS、CK、ALK-D5F3、CD20、ALK/EML4、Beta-catenin、E-Cadherin、EP-CAM、HPV、IDH-1、PSA、PSMA、VEGF、GFAP、细胞角蛋白、AE1/AE3、雌激素受体、孕激素受体、BCA-225、CA125、CEA、EMA、ERCC1、HPV、Ki-67、P53、TOP2A等作为CTCs表达的示踪剂，注册超灵敏、超快速、高覆盖、低成本、准确特异的鉴定诊断试剂盒，通过与在济南注册的山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司合作进行产业化推广。
技术实现思路
为了克服多次或实时检测的问题，同时避免穿刺活检面临出血、胰瘘、感染等风险，本专利技术提供了一种检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞CA199表达的免疫荧光试剂盒及检测方法，利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚期或复发胰腺癌患者外周血中的CTC，进一步运用免疫荧光技术检测CTC的CA199表达情况。本专利技术采用的技术方案如下：一种检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞CA199表达的免疫荧光试剂盒，包括稀释液45mL，脱色液1mL，染色液A0.5mL，染色液B1mL，200μl甲醇、200μl2%PFA，100μl10%山羊血清，小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗CA199组成的一抗混悬液100μl，荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔组成的二抗混悬液100μL，DAPI封片剂；一抗混悬液中小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗CA199分别按1:100、1:400和1:500稀释，总体积为100μL；二抗混悬液中荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔按1:500稀释。所述稀释液为氯化钾19g/L，乙二胺四乙酸二钾4.8g/L，吡啶鎓钠2.6g/L，磷酸二氢钾17g/L，氢氧化钠9g/L，羟乙基哌嗪乙硫磺酸0.2g/L，二羟基甲基脲2g/L，余量为纯化水。所述脱色液是由0.5%盐酸-70%乙醇溶液组成。所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。上述免疫荧光试剂盒非诊断目的检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞CA199表达的方法，包括以下步骤：（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发胰腺癌患者外周血中的CTC：采集无法获取组织标本的晚期或复发胰腺癌患者外周血：肘正中静脉外周血5ml；（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液45ml进行稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；（3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血CTC：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；（4）过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器，将循环肿瘤细胞染色液A液0.5ml加入到滤器中，染色3min，PBS缓冲液冲洗干净；滤液过滤完全后加入染色液B液1ml，染色2min，纯水1ml冲洗2次；（5）向滤器中加入200μl2%PFA，室温固定5min，完成后0.5mlPBS漂洗3次，每次2min；（6）再向滤器中加入200μl预冷的甲醇，4℃固定15min，取下滤膜，放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC；（7）运用免疫荧光方法检测外周血CTC的CA199表达情况。步骤（7）所述检测CTC的CA199表达的具体方法如下：S1脱色：将带有CTC的滤膜从载玻片上取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液；S2封闭：羊血清用PBS稀释，向滤膜上滴加100μl10%山羊血清，室温放置30min，完成后吸去多余的血清；S3一抗孵育：向滤膜上滴加100μl小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗CA199组成的一抗混悬液，37℃孵育1h或4℃过夜，完成后PBS洗3min×3次；S4二抗孵育：向滤膜上滴加100μl荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔组成的二抗混悬液，室温孵育30min，完成后PBS洗2min×3次；S5使用含DAPI的封片剂封片，阅片，采图；S6采图完成后，脱片后进行瑞氏吉姆萨染色，与IF结果进行对比。本专利技术所使用的膜过滤分离肿瘤细胞装置，包括滤器、血样容器、废液缸和铁架台，所述铁架台设有底座、立架和支架，所述血样容器通过支架设置于铁架台上部，血样容器的下方为滤器，滤器通过输液器联通至废液缸，废液缸设置于底座上。所述滤器包括滤器上口、滤膜、载滤膜平台和滤器下口，滤膜置于载滤膜平台上；滤器上口接血样容器，滤器下口通过输液器接废液缸。所述滤膜为疏水材料制成，其上均匀布满口径为8微米的滤孔。本专利技术的有益效果是：（1）本专利技术提供的检测方法，不用穿刺活检获取组织标本即可检测到晚期或复发胰腺癌患者CA199表达情况。该技术属于微创，并能够实时检测。（2）本专利技术提供的方法，能够避免染色过程中可能产生的边缘效应导致的假阳性结果本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞CA199表达的免疫荧光试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL，脱色液1mL，染色液A 0.5mL，染色液B 1mL，200μl 甲醇、200μl 2%PFA，100μl10%山羊血清，小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗CA199组成的一抗混悬液100μl，荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔组成的二抗混悬液100μL，DAPI封片剂；/n一抗混悬液中小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗CA199分别按1:100、1:400和1:500稀释，总体积为100μL；/n二抗混悬液中荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔按1:500稀释。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞CA199表达的免疫荧光试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL，脱色液1mL，染色液A0.5mL，染色液B1mL，200μl甲醇、200μl2%PFA，100μl10%山羊血清，小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗CA199组成的一抗混悬液100μl，荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔组成的二抗混悬液100μL，DAPI封片剂；
一抗混悬液中小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗CA199分别按1:100、1:400和1:500稀释，总体积为100μL；
二抗混悬液中荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔按1:500稀释。


2.根据权利要求1所述的免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述稀释液为氯化钾19g/L，乙二胺四乙酸二钾4.8g/L，吡啶鎓钠2.6g/L，磷酸二氢钾17g/L，氢氧化钠9g/L，羟乙基哌嗪乙硫磺酸0.2g/L，二羟基甲基脲2g/L，余量为纯化水。


3.根据权利要求1所述的免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述脱色液是由0.5%盐酸-70%乙醇溶液组成。


4.根据权利要求1所述的免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。


5.一种利用权利要求1-4任一项所述的免疫荧光试剂盒非诊断目的检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞CA199表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发胰腺癌患者外周血中的CTC：采集无法获取组织标本的晚期或复发胰腺癌患者外周血：肘正中静脉外周血5ml；
（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液45ml进行稀释，稀释...

【专利技术属性】
技术研发人员：李浩，李胜，高德海，崔凯，夏梅，
申请(专利权)人：山东第一医科大学山东省医学科学院，
类型：发明
国别省市：山东;37