一种在筛选新生抗原疫苗或药物时评价动物模型的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种在筛选新生抗原的疫苗或药物时评价动物模型的引物和探针，创建了其检测方法，并将其制作成试剂盒，该试剂盒通过检测人源肿瘤细胞来筛选和评价新抗原多肽疫苗、核酸疫苗及新抗原反应性细胞药物等动物模型的规范化和一致性，试剂盒操作简单、灵敏度高，灵敏度可达到单细胞水平。

【技术实现步骤摘要】
一种在筛选新生抗原疫苗或药物时评价动物模型的方法及应用
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种在筛选新生抗原疫苗或药物中评价动物模型的方法及应用。
技术介绍
目前，在筛选新生抗原疫苗和药物过程中，通常采用荧光素酶动物成像和循环肿瘤细胞定量检测检测结果，来评价实验动物模型的规范化和一致性。荧光素酶动物成像是将荧光素酶基因整合到肿瘤细胞中，培养出能稳定表达荧光素酶的肿瘤细胞株，将标记好的肿瘤细胞接种到实验动物体内后，通过检测设备观察外源肿瘤细胞位置来观测实验动物模型的肿瘤状态。循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCells，CTCs)是指自发或因诊疗操作进入外周血循环的肿瘤细胞。大量研究证实，外周血CTCs检测操作简单、准确定高，目前被认为最好及最客观的检测手段之一。CTCs的检测方法分为两类，基于玻片的免疫细胞化学技术(immunocytochemistry,ICC)和基于PCR(包括RT-PCR，巢式PCR等)的分子生物学技术。ICC法被称为评价CTC检测方法的金标准，其优点包括：直观、简便，但肿瘤细胞表面抗原表达不均一、淋巴细胞的部分交叉反应等因素影响检测的特异性和敏感性。基于PCR的检测技术是利用组织或肿瘤特异性mRNA的表达或某些基因改变后RNA水平异常的原理，这些mRNA标志不表达于正常外周血细胞，达到检测CTC的目的。该方法高效、特异、灵敏且操作简便，结果判定客观，是目前检测CTC最有效的方法。肿瘤新抗原是体细胞基因由于理化损伤因素诱发或自发突变而产生的具有免疫原性的新生抗原。肿瘤新抗原只存在于肿瘤细胞而不存在于正常细胞，正是由于这些特点，肿瘤新抗原可以引发有效、安全和高度特异性的抗肿瘤免疫反应。因此，个性化新抗原疫苗目前被认为是一种极其有效且安全的免疫治疗。通过比较肿瘤组织和正常组织的全外显子和转录组数据，结合机器学习算法，国际上已开发出多种预测新抗原的软件工具，如pVAC-seq、TSNAD、Neopepsee等。这些软件预测新抗原的免疫原性需要通过各种体外和体内免疫学实验来验证，如酶联免疫斑点实验(enzyme-linkedimmunospotassay，ELISPOT)、胞内因子染色实验(intracellularcytokinestaining，ICS)、突变体-HLA分子四聚体(pHLAmultimer)、靶细胞杀伤或动物模型体内实验等方法。其中荷瘤动物模型如将人源的肿瘤细胞系接种到免疫缺陷小鼠体内的CDX模型(cell-line-derivedxenograft)和将来源于患者的肿瘤组织块接种到免疫缺陷小鼠体内的PDX模型(patient-derivedxenograft)更能全面评价新抗原预测软件的预测准确率。由于肿瘤细胞的异质性，现有技术中，在异源肿瘤细胞评价试验中，免疫细胞化学技术和分子生物技术均可以用于循环肿瘤细胞的鉴定。但免疫细胞化学技术依赖特异性的抗肿瘤抗原抗体，而且由于技术的局限性，免疫细胞化学技术只能使用2-3个肿瘤marker，且判断依赖人工，容易出现主观偏差；分子生物学技术，主要通过肿瘤细胞基因的特异性表达来评价肿瘤细胞的发展情况，但特异性表达基因的差异区段碱基差异性小、表达量不稳定状况，致使检测结果不稳定。因此，如何提供一种操作简单、灵敏度高、稳定性强评价荷瘤动物模型一致性的方法是本领域亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术公开了一种人源循环肿瘤细胞的检测探针和引物，可对荷瘤动物模型进行准确、规范的评价。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种用于检测人源循环肿瘤细胞的引物和探针，其特征在于，引物包括PF1：SEQIDNO.1、PR1：SEQIDNO.2、PF2：SEQIDNO.4、PR2：SEQIDNO.5所述核苷酸序列，探针包括P1：SEQIDNO.3、P2：SEQIDNO.6所示核苷酸序列，且探针的5’端有荧光基团，3’端有淬灭基团；所述PF1：CGGTCTGTACTTCTGTAC，SEQIDNO.1；所述PR1：GACAGAGATCTGGTAATTCA，SEQIDNO.2；所述P1：CACTGTCTTGCTCCACGCTG，SEQIDNO.3；所述PF2：AGCCTAAGATGAGAGTTC，SEQIDNO.4；所述PR2：CACAGAACTAGAACATTGATA，SEQIDNO.5；所述P2：ATCTGGAGTCCTATTGACATCGCC，SEQIDNO.6；其中，PF1、PR1和P1配套使用，PF2、PR2和P2配套使用；一种检测循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的引物和探针在动物实验模型中检测循环肿瘤细胞的应用；一种检测循环肿瘤细胞的方法，具体包括：(1)提取动物血液样本中的RNA；(2)将提取的RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板；以PF1/PR1为引物，以P1为探针或以PF2/PR2为引物，以P2为探针；进行实时荧光PCR扩增反应；(3)根据荧光PCR扩增仪的结果计算血液样本中存在人源肿瘤细胞的数量；一种在筛选新生抗原疫苗或药物时评价动物模型的方法，在筛选新生抗原疫苗或药物过程中建立动物模型，利用上述引物和探针检测模型动物中循环肿瘤细胞，评价动物模型的规范化和一致性；动物模型包括人源肿瘤细胞系异种移植动物模型和人源肿瘤组织来源移植瘤模型；新生抗原疫苗包括多肽疫苗、核酸疫苗、新抗原反应性细胞；一种用于检测人源循环肿瘤细胞的试剂盒，包括：上述配套使用的引物、探针，还包括：RNA逆转录反应液、RT-PCR反应液；RNA逆转录反应液包括：反转录引物、dNTPs、反转录缓冲液、DTT、MgCl2、RNA酶抑制剂、反转录酶、RNaseH；优选的，反转录引物为oligo(dT)；优选的，RNA酶抑制剂为重组RNA酶抑制剂；RT-PCR反应液包括：上游引物、下游引物、探针、TaqmanUniversalMasterMixⅡ和DEPC水；上下游引物浓度为400M，探针浓度为200nM；一种用于检测人源循环肿瘤细胞的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：(1)提取检测样本中的RNA；(2)将提取的样本RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光PCR扩增反应；(3)根据荧光PCR扩增仪的结果对样本存在人源肿瘤细胞的数量；反应条件为：94-98℃预运行2-15分钟；94-98℃运行5-20秒，58-60℃运行40-80分钟，运行重复40-45个循环；优选的，反应条件为：95℃预运行10分钟；95℃运行15秒，60℃运行1分钟，运行重复40个循环；根据不同数目肿瘤细胞与检测引物的Ct值之间的关系，建立标准曲线，标准曲线。基于标准曲线，通过实时定量PCR检测的Ct值，推出样品中肿瘤细胞的数目。所述试剂盒用于评价筛选新生抗原疫苗或药物时所用动物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测人源循环肿瘤细胞的引物和探针，其特征在于，引物包括P F1：SEQ IDNO.1、PR1：SEQ ID NO.2、PF2：SEQ ID NO.4、PR2：SEQ I D NO.5所述核苷酸序列，探针包括P1：SEQ ID NO.3、P2：SEQ ID NO.6所示核苷酸序列，且探针的5’端有荧光基团，3’端有淬灭基团；/n所述PF1：CGGTCTGTACTTCTGTAC，SEQ ID NO.1；/n所述PR1：GACAGAGATCTGGTAATTCA，SEQ ID NO.2；/n所述P1：CACTGTCTTGCTCCACGCTG，SEQ ID NO.3；/n所述PF2：AGCCTAAGATGAGAGTTC，SEQ ID NO.4；/n所述PR2：CACAGAACTAGAACATTGATA，SEQ ID NO.5；/n所述P2：ATCTGGAGTCCTATTGACATCGCC，SEQ ID NO.6。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测人源循环肿瘤细胞的引物和探针，其特征在于，引物包括PF1：SEQIDNO.1、PR1：SEQIDNO.2、PF2：SEQIDNO.4、PR2：SEQIDNO.5所述核苷酸序列，探针包括P1：SEQIDNO.3、P2：SEQIDNO.6所示核苷酸序列，且探针的5’端有荧光基团，3’端有淬灭基团；
所述PF1：CGGTCTGTACTTCTGTAC，SEQIDNO.1；
所述PR1：GACAGAGATCTGGTAATTCA，SEQIDNO.2；
所述P1：CACTGTCTTGCTCCACGCTG，SEQIDNO.3；
所述PF2：AGCCTAAGATGAGAGTTC，SEQIDNO.4；
所述PR2：CACAGAACTAGAACATTGATA，SEQIDNO.5；
所述P2：ATCTGGAGTCCTATTGACATCGCC，SEQIDNO.6。


2.一种在筛选新生抗原疫苗或药物时评价动物模型的方法，其特征在于，在筛选新生抗原疫苗或药物过程中建立动物模型，利用权利要求1所述的引物和探针检测模型动物中循环肿瘤细胞，评价动物模型的规范化和一致性。


3.根据权利要求2所述的在筛选新生抗原疫苗或药物时评价动物模型的方法，其特征在于，动物模型包括人源肿瘤细胞系异种移植动物模型和人源肿瘤组织来源移植瘤模型。


4.根据权利要求2所述的在筛选新生抗原疫苗或药物时评价动物模型的方法，其特征在于，所述新生抗原疫苗包括：多肽疫苗、...

【专利技术属性】
技术研发人员：冷国庆，张琪，苏宏健，郝淮杰，田辉，王丽莉，杨文龙，余荣熹，冷宁，王艳，张凤莲，景文岩，于佳正，黄天一，冷青，
申请(专利权)人：哈尔滨吉象隆生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23