一种生物催化法生产2,5-二甲基吡嗪的方法技术

本发明专利技术公开了一种生物催化法生产2,5‑二甲基吡嗪的方法，涉及生物催化技术领域。本发明专利技术于LB培养基中添加氨苄青霉素作为液体培养基，培养2,5‑二甲基吡嗪合成酶菌株，得种子培养物，对所得种子培养物进行发酵、补糖处理，得发酵处理物，再对发酵处理物进行诱导处理，得2,5‑二甲基吡嗪合成酶，接着以L‑苏氨酸为底物，采用所得酶进行生物催化，得到2,5‑二甲基吡嗪。本发明专利技术公布了一种全新的合成路线，反应条件温和，原料价格低廉，并可避免化学合成造成的环境污染。本发明专利技术解决了目前制备2,5‑二甲基吡嗪常用采用化学合成，合成过程的条件苛刻，并有毒气散发和爆炸的危险，往往会造成严重污染，所用试剂成本高的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种生物催化法生产2,5-二甲基吡嗪的方法
本专利技术属于生物催化
，尤其涉及一种生物催化法生产2,5-二甲基吡嗪的方法。
技术介绍
2,5-二甲基吡嗪是一种无色至微黄色液体，沸点155℃，闪点64℃，混溶于水和有机溶剂。天然品存在于球茎甘兰、猪肉、朗姆酒、可可、咖啡、土豆片、河虾等中。该品具有坚果香、花生、霉味、壤香、土豆、脂肪香、可可粉的气味，7.5mg/kg的溶液具有坚果、土豆、脂肪的味道，是我国GB-2760-86规定为允许使用的香料，主要用于配制可可、咖啡、肉类、坚果和马铃薯等型香精，还可用于染料及制药工业。目前2,5-二甲基吡嗪的合成方法主要有以下几种：1.由含有活泼亚甲基的酮类化合物合成。首先用亚硝酸盐把含有活泼亚甲基的酮还原成α-氨基酮，然后脱水环化生成二氢吡嗪，进一步脱氢生成吡嗪。该方法反应步骤多，不适宜大规模工业化生产。2.以一异丙醇胺和乙二胺为原料，采用氨水沉淀法制备反应所需的催化剂，由α-二胺和α-乙醇胺合成2,5-二甲基吡嗪。此法虽然工艺路线短，但选择性差，不能得到单一产物，产品分离较困难。3.在铵盐的存在下，丙烯醛和氨在甘油中加热反应可得到2,5-二甲基吡嗪，但丙烯醛为剧毒物质且反应过程易发生爆炸，故不宜采用此法。4.由α-二胺和环氧丙烷合成，该法采用气固相接触催化反应，产物是2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪的混合物，产品分离、纯化困难。5.以一异丙醇胺为原料，气固催化合成2,5-二甲基吡嗪，不同催化剂的结果也相差较大，铝硅酸盐沸石和氧化锌做催化剂时收率较低，含银催化剂的工业制备成本较高。目前制备2,5-二甲基吡嗪常用采用化学合成，合成过程的条件苛刻，并有毒气散发和爆炸的危险，往往会造成严重污染，所用试剂成本高的问题。因而对全新的温和、能够降低生产成本的工艺具有迫切的需求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：为了解决目前制备2,5-二甲基吡嗪常用采用化学合成，合成过程的条件苛刻，并有毒气散发和爆炸的危险，往往会造成严重污染，所用试剂成本高的问题，而提出的一种生物催化法生产2,5-二甲基吡嗪的方法。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：一种生物催化法生产2,5-二甲基吡嗪的方法，该方法如下：(1)于LB培养基中添加抗生素作为液体培养基；(2)以步骤(1)所得液体培养基培养2,5-二甲基吡嗪合成酶菌株，得种子培养物；(3)对步骤(2)所得种子培养物进行发酵；(4)对步骤(3)的发酵过程进行补糖处理，继续发酵，得发酵处理物；(5)对步骤(4)所得发酵处理物进行诱导处理，得2,5-二甲基吡嗪合成酶；(6)以L-苏氨酸为底物，采用步骤(5)所得2,5-二甲基吡嗪合成酶进行生物催化。作为上述技术方案的进一步描述：所述LB培养基：按质量份数计，取11～14份KH2PO4、3～5份(NH4)2SO4、1.2～2.5份一水合柠檬酸、0.4～0.8份MgSO4·7H2O、8～12份一水合葡萄糖、1000份水混合，灭菌，即得LB培养基；所述步骤(1)～(5)构成2,5-二甲基吡嗪合成酶菌株的高密度发酵表达的过程。作为上述技术方案的进一步描述：所述一种生物催化法生产2,5-二甲基吡嗪的方法，该方法包括如下步骤：(1)液体培养基的制备：按质量份数计，取11～14份KH2PO4、3～5份(NH4)2SO4、1.2～2.5份一水合柠檬酸、0.4～0.8份MgSO4·7H2O、8～12份一水合葡萄糖、1000份水混合，灭菌，冷却至20～39℃，加入无菌水质量1‰的抗生素混合，得液体培养基；(2)种子培养物的制备：按5％的接种量取2,5-二甲基吡嗪合成酶菌株在液体培养基中培养，控制温度为37℃，培养4～6h，得种子培养物；(3)发酵过程控制：调节步骤(2)所得种子培养物的pH，密闭通气维持内部溶氧量为总质量的30～60％，于37℃震荡摇床，保温发酵处理；(4)补糖处理：对步骤(3)的发酵过程进行补糖处理，控制溶氧为总质量的20～30％，根据溶氧调整补糖速率，控制残糖浓度为0～0.1g/L；(5)诱导处理：待发酵培养过程经过12～14h，控制菌体OD600值为20～40，则降温，按质量体积比为0.01～1％加入诱导剂，震荡摇床诱酶表达10～24h，得2,5-二甲基吡嗪合成酶；(6)生物催化：按质量份数计，取78～100份Tris-HCl缓冲液、5～80份2,5-二甲基吡嗪合成酶、1～100份底物、0～6份NAD+液混合，于20～40℃反应，出料，即得2,5-二甲基吡嗪。作为上述技术方案的进一步描述：所述一种生物催化法生产2,5-二甲基吡嗪的方法，该方法具体包括如下步骤：(1)液体培养基的制备：按质量份数计，取11～14份KH2PO4、3～5份(NH4)2SO4、1.2～2.5份一水合柠檬酸、0.4～0.8份MgSO4·7H2O、8～12份一水合葡萄糖、1000份水混合，于121℃保温灭菌12～20min后，自然冷却至20～39℃，加入无菌水质量1‰的抗生素混合均匀，得液体培养基；(2)种子培养物的制备：按5％的接种量取2,5-二甲基吡嗪合成酶菌株在液体培养基中培养，控制温度为37℃，培养4～6h，控制OD600为1.8～2.0，得种子培养物；(3)发酵过程控制：调节步骤(2)所得种子培养物的pH至4～8，移至可通气试管进行密闭并控制通气速率为1～1.5mL/min维持其内部溶氧量为总质量的30～60％，于20～40℃，以220r/min震荡摇床，保温发酵处理6～8h，并控制OD600值在9.7～10.3；(4)补糖处理：对步骤(3)的发酵过程的第8～30h期间内补充一水葡萄糖，控制溶氧为总质量的20～30％，控制残糖浓度为0～0.1g/L；(5)诱导处理：待发酵培养过程经过12～14h，控制菌体OD600值为20～40，则降温至20～37℃，按质量体积比为0.01～1％加入诱导剂混合，以220r/min震荡摇床诱酶表达10～24h，得2,5-二甲基吡嗪合成酶；(6)生物催化：按质量份数计，取78～100份浓度0.5M且pH值为6.0～8.5的Tris-HCl缓冲液、5～80份2,5-二甲基吡嗪合成酶、1～100份底物、0～6份浓度为0～1mM的NAD+液混合，于20～40℃，反应25～30h，出料，灭酶，即得2,5-二甲基吡嗪。作为上述技术方案的进一步描述：所述步骤(1)中的抗生素为浓度50μg/mL的氨苄青霉素。作为上述技术方案的进一步描述：所述步骤(5)中的酶诱导剂为浓度5g/L的乳糖溶液、浓度30～50ppm的异丙基硫代半乳糖苷中的任意一种。作为上述技术方案的进一步描述：所述步骤(5)或步骤(6)中的酶为2,5-二甲基吡嗪合成酶。作为上述技术方案的进一步描述：所述2,5-二甲基吡嗪合成酶的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生物催化法生产2,5-二甲基吡嗪的方法，其特征在于，该方法如下：/n(1)于LB培养基中添加抗生素作为液体培养基；/n(2)以步骤(1)所得液体培养基培养2,5-二甲基吡嗪合成酶菌株，得种子培养物；/n(3)对步骤(2)所得种子培养物进行发酵；/n(4)对步骤(3)的发酵过程进行补糖处理，继续发酵，得发酵处理物；/n(5)对步骤(4)所得发酵处理物进行诱导处理，得2,5-二甲基吡嗪合成酶；/n(6)以L-苏氨酸为底物，采用步骤(5)所得2,5-二甲基吡嗪合成酶进行生物催化。/n

【技术特征摘要】
1.一种生物催化法生产2,5-二甲基吡嗪的方法，其特征在于，该方法如下：
(1)于LB培养基中添加抗生素作为液体培养基；
(2)以步骤(1)所得液体培养基培养2,5-二甲基吡嗪合成酶菌株，得种子培养物；
(3)对步骤(2)所得种子培养物进行发酵；
(4)对步骤(3)的发酵过程进行补糖处理，继续发酵，得发酵处理物；
(5)对步骤(4)所得发酵处理物进行诱导处理，得2,5-二甲基吡嗪合成酶；
(6)以L-苏氨酸为底物，采用步骤(5)所得2,5-二甲基吡嗪合成酶进行生物催化。


2.根据权利要求1所述一种生物催化法生产2,5-二甲基吡嗪的方法，其特征在于，所述LB培养基：按质量份数计，取11～14份KH2PO4、3～5份(NH4)2SO4、1.2～2.5份一水合柠檬酸、0.4～0.8份MgSO4·7H2O、8～12份一水葡萄糖、1000份水混合，灭菌，即得LB培养基；
所述步骤(1)～(5)构成2,5-二甲基吡嗪合成酶菌株的高密度发酵表达的过程。


3.根据权利要求1所述一种生物催化法生产2,5-二甲基吡嗪的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)液体培养基的制备：按质量份数计，取11～14份KH2PO4、3～5份(NH4)2SO4、1.2～2.5份一水合柠檬酸、0.4～0.8份MgSO4·7H2O、8～12份一水合葡萄糖、1000份水混合，灭菌，冷却至20～39℃，加入无菌水质量1‰的抗生素混合，得液体培养基；
(2)种子培养物的制备：按5％的接种量取2,5-二甲基吡嗪合成酶菌株在液体培养基中培养，控制温度为37℃，培养4～6h，得种子培养物；
(3)发酵过程控制：调节步骤(2)所得种子培养物的pH，密闭通气维持内部溶氧量为总质量的30～60％，震荡摇床，保温发酵处理；
(4)补糖处理：对步骤(3)的发酵过程补糖处理，控制溶氧为总质量的20～30％，控制残糖浓度为0～0.1g/L；
(5)诱导处理：待发酵培养过程经过12～14h，控制菌体OD600值为20～40，降温，按质量体积比为0.01～1％加入诱导剂震荡摇床诱酶表达10-24h，得2,5-二甲基吡嗪合成酶；
(6)生物催化：按质量份数计，取78～100份Tris-HCl缓冲液、5～80份2,5-二甲基吡嗪合成酶、1～100份底物、0～6份NAD+液混合反应，出料，灭酶，即得2,5-二甲基吡嗪。


4.根据权利要求3所述一种生物催化法生产2,5-二甲基吡嗪的方法，其特征在于，该方法具体包括如下步骤：
(1)液体培养基的制备：按质量份数计，取11～14份KH2PO4、3～5份(NH4)2SO4、1.2～2.5份一水合柠檬酸、0.4～...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭宏明，
申请(专利权)人：江苏惠利生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32