一种高通量药敏检测试剂盒及其使用方法和应用技术

本发明专利技术属于药物筛选技术领域，本发明专利技术提供了一种高通量药敏检测试剂盒及其使用方法和应用。本发明专利技术的高通量药敏检测试剂盒，包括培养容器、培养基和检测试剂，所述检测试剂是包括吩嗪甲基硫酸盐衍生物和含四氮唑盐的氧化试剂的混合物。本发明专利技术提供的高通量药敏检测试剂盒具有快速精准、经济简便、安全无毒、可以目测、临床相关性高的特点，使用方法简单，具有较高的精准性、灵敏性，且能够一次性筛查大量的抗菌药物。

【技术实现步骤摘要】
一种高通量药敏检测试剂盒及其使用方法和应用
本专利技术涉及药敏检测
，尤其涉及一种高通量药敏检测试剂盒及其使用方法和应用。
技术介绍
结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌所引起的一种慢性空气传染疾病，虽然结核分枝杆菌主要是侵染肺部，但是它几乎可以侵入人体全身的各种器官，它一直是威胁全球人类健康的重大公共卫生问题。非结核分枝杆菌(Nontuberculosismycobacteria，NTM)是指除结核杆菌及麻风杆菌以外的所有分枝杆菌，也称为环境分枝杆菌。非结核分枝杆菌广泛存在于自然界的土壤、尘埃、水、鱼类和家禽中，传播途径主要是从环境中获得感染，例如污水，而人与人之间的传染极少见。非结核分枝杆菌属于条件致病菌，健康人的呼吸道可有某些类型的非结核分枝杆菌寄植，当口腔和呼吸道卫生状况改善后可消失。通常非结核分枝杆菌对人类致病性较结核分枝杆菌低，但如果存在易感因素，使宿主局部或全身免疫功能发生障碍，也可导致病变。迄今为止，结核病已有几千年的历史，随着环境的改变耐药结核杆菌也随之出现，而在过去的40年中却未开发出能有效杀灭耐药菌株的新型抗结核药物，未来数年内可能会出现以耐药甚至耐多药结核杆菌为主的结核病的流行趋势，全球医疗工作者将会面临更加严重的挑战。目前现有的结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的药敏检测方法主要是细菌培养法和分子生物学方法。(1)细菌培养法主要分为固体培养和液体快速培养。固体培养法主要是利用罗氏固体培养基，将菌种接种到固体斜面上，置于37℃培养，按时间进行观察，根据菌落形态，初次生长的时间，以及是否产生色素等特点来进行判断是否为结核分枝杆菌。此法是目前全球普遍采用的细菌分离培养法，方法简便，但是由于细菌生长缓慢，导致其耗时长，一般要4～8周才能报道结果，而且其特异性差，不利于临床初断。近年来，以液体培养法为基础的细菌培养方法得到了广泛的应用。目前，常用的自动检测仪器有BACTECMGIT960系统、BacT/ALERT3D微生物检测系统、VersaTREK/ESP培养系统Ⅱ等。上述液体培养法虽然缩短了培养时间，提高了灵敏性，但是也存在判定方法不直观、污染率高、价格昂贵、工作量大的缺点，限制了一些中小型的实验室以及高负担资源的国家采用这些设备。(2)分子生物学方法。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，其在分枝杆菌中的应用也不断增多，目前临床诊断实验室最常用的分子生物学技术有核酸杂交探针、线性杂交检测、DNA测序等。但是分子生物学方法步骤繁多，每个药的检测成本高。比色法检测多步操作，在微孔板中进行，精准度不高。可见，现有的结核病的药敏检测方法均存在一些缺陷。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高通量药敏检测试剂盒及其使用方法和应用，本专利技术的药敏检测试剂盒具有高通量、快速精准、经济简便、安全无毒、可以目测、临床相关性高的特点，能够发现传统方法发现不了的异质性耐药。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：一种高通量药敏检测试剂盒，包括培养容器、培养基和检测试剂，所述检测试剂是包括吩嗪甲基硫酸盐衍生物和含四氮唑盐的氧化试剂的混合物。优选的，所述检测试剂中所述含四氮唑盐的氧化试剂的浓度为0.001～10mM，所述吩嗪甲基硫酸盐衍生物的浓度为0.1～250μM。优选的，所述含四氮唑盐的氧化试剂在氧化还原后具有吸光度或荧光度，所述含四氮唑盐的氧化试剂为单磺酸四氮唑盐、羧酸四氮唑盐、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐和四氮唑蓝盐中的一种。优选的，所述吩嗪甲基硫酸盐衍生物的结构通式为：其中，R表示1～18个碳原子的直链、支链或环状烷基，或者表示包含N、O、S、P、Si和卤素原子中的一种或几种杂原子的1～18个碳原子的直链、支链或环状烷基衍生物。本专利技术还提供了一种高通量药敏检测试剂盒用于筛选抗结核病药物的应用。本专利技术还提供了一种高通量药敏检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：(1)将按照终浓度配制的不同浓度梯度的待检药物包被到培养容器中制得含药培养容器；(2)将活菌与培养基、检测试剂混合，加入到含药培养容器中，封存培养，每天检测培养液在OD450nm处的吸光度，绘制生长曲线；以待检药物浓度为0的生长曲线为活菌的标准生长曲线，设为对照组，其他设为加药组；并设立空白组，所述空白组与加药组的区别在于没有加活菌；培养至对照组与空白组在OD450nm处的吸光度的比值为3时，培养结束；并根据对照组的标准生长曲线和加药组的生长曲线数据计算细胞活力值，绘制药物剂量效应曲线；(3)按照如下公式计算细胞活力值：细胞活力值(％)＝[OD(加药)-OD(空白)]/[OD(对照)-OD(空白)]×100其中：OD(加药)：表示具有活菌、培养基、检测试剂、待检药物的培养液在OD450nm处的吸光度；OD(对照)：表示具有活菌、培养基、检测试剂的培养液在OD450nm处的吸光度；OD(空白)：表示具有培养基、检测试剂、待检药物的培养液在OD450nm处的吸光度；(4)根据含药培养容器中培养液的颜色变化，获得最低抑菌浓度值，或根据EZMTT法测得的待测药物各浓度梯度的生长曲线对照标准生长曲线，获得最低抑菌浓度值，或根据药物剂量效应曲线，获得最低抑菌浓度值，将获得的最低抑菌浓度值与CLSI标准中对应的最低抑菌浓度值比较，判定是否耐药。优选的，所述待检药物包括异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、链霉素、链霉素硫酸盐、阿米卡星、硫酸阿米卡星、左氧氟沙星、莫西沙星、莫西沙星盐酸盐、环丝氨酸、丙硫异烟胺、利奈唑胺、氯法齐明、贝达喹啉富马酸盐、卡那霉素、卷曲霉素、妥布霉素、对氨基水杨酸、强力霉素、克拉霉素、替加环素、贝达喹啉中的一种或几种，所述异烟肼的终浓度为0.05-256μg/ml、利福平的终浓度为0.1-256μg/ml、吡嗪酰胺的终浓度为100-400μg/ml、乙胺丁醇的终浓度为1-256μg/ml、链霉素的终浓度为0.01-256μg/ml、链霉素硫酸盐的终浓度为0.01-256μg/ml、阿米卡星的终浓度为0.01-16μg/ml、硫酸阿米卡星的终浓度为0.01-16μg/ml、左氧氟沙星的终浓度为0.01-32μg/ml、莫西沙星的终浓度为0.03-16μg/ml、莫西沙星盐酸盐的终浓度为0.03-16μg/ml、环丝氨酸的终浓度为10-400μg/ml、丙硫异烟胺的终浓度为1-20μg/ml、利奈唑胺的终浓度为0.1-64μg/ml、氯法齐明的终浓度为0.02-2μg/ml、贝达喹啉富马酸盐的终浓度为0.01-1μg/ml、卡那霉素的终浓度为1-200μg/ml、卷曲霉素的终浓度为1-200μg/ml、妥布霉素的终浓度为0.1-16μg/ml、对氨基水杨酸的终浓度为1-10μg/ml、强力霉素的终浓度为1-16μg/ml、克拉霉素的终浓度为2-8μg/ml、替加环素的终浓本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高通量药敏检测试剂盒，其特征在于，包括培养容器、培养基和检测试剂，所述检测试剂是包括吩嗪甲基硫酸盐衍生物和含四氮唑盐的氧化试剂的混合物。/n

【技术特征摘要】
1.一种高通量药敏检测试剂盒，其特征在于，包括培养容器、培养基和检测试剂，所述检测试剂是包括吩嗪甲基硫酸盐衍生物和含四氮唑盐的氧化试剂的混合物。


2.如权利要求1所述的一种高通量药敏检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂中所述含四氮唑盐的氧化试剂的浓度为0.001～10mM，所述吩嗪甲基硫酸盐衍生物的浓度为0.1～250μM。


3.如权利要求1或2所述的一种高通量药敏检测试剂盒，其特征在于，所述含四氮唑盐的氧化试剂在氧化还原后具有吸光度或荧光度，所述含四氮唑盐的氧化试剂为单磺酸四氮唑盐、羧酸四氮唑盐、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐和四氮唑蓝盐中的一种。


4.如权利要求1或2所述的一种高通量药敏检测试剂盒，其特征在于，所述吩嗪甲基硫酸盐衍生物的结构通式为：



其中，R表示1～18个碳原子的直链、支链或环状烷基，或者表示包含N、O、S、P、Si和卤素原子中的一种或几种杂原子的1～18个碳原子的直链、支链或环状烷基衍生物。


5.权利要求1～4任意一项所述的一种高通量药敏检测试剂盒用于筛选抗结核病药物的应用。


6.权利要求1～4任意一项所述的一种高通量药敏检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将按照终浓度配制的不同浓度梯度的待检药物包被到培养容器中制得含药培养容器；
(2)将活菌与培养基、检测试剂混合，加入到含药培养容器中，封存培养，每天检测培养液在OD450nm处的吸光度，绘制生长曲线；以待检药物浓度为0的生长曲线为活菌的标准生长曲线，设为对照组，其他设为加药组；并设立空白组，所述空白组与加药组的区别在于没有加活菌；培养至对照组与空白组在OD450nm处的吸光度的比值为3时，培养结束；并根据对照组的标准生长曲线和加药组的生长曲线数据计算细胞活力值，绘制药物剂量效应曲线；
(3)按照如下公式计算细胞活力值：
细胞活力值(％)＝[OD(加药)-OD(空白)]/[OD(对照)-OD(空白)]×100
其中：OD(加药)：表示具有活菌、培养基、检测试剂、待检药物的培养液在OD450nm处的吸光度；
OD(对照)：表示具有活菌、培养基、检测试剂的培养液在OD450nm处的吸光度；
OD(空白)：表示具有培养基、检测试剂、待检药物的培养液在OD450nm处的吸光度；
(4)根据含药培养容器中培养液的颜色变化，获得最低抑菌浓度值，或根据EZMTT法测得的待测药物各浓度梯度的生长曲线对照标准生长曲线，获得最低抑菌浓度值，或根据药物剂量效应曲线，获得最低抑菌浓度值，将获得的最低抑菌浓度值与CLSI标准中对应的最低抑菌浓度值比较，判定是否耐药。


7.如权利要求6所述的一种高通量药敏检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：阮奔放，
申请(专利权)人：杭州伽玛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33