一种用于原代小鼠角膜上皮细胞体外培养的组合物及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种用于原代小鼠角膜上皮细胞体外培养的组合物及其用途，利用Forskolin、SB431542、DAPT、IWP‑2、LDN‑193189这5种小分子化合物与传统培养原代小鼠角膜上皮细胞的ROCK抑制剂Y27632联合使用，可以有效地解决原代小鼠角膜上皮细胞体外培养的贴壁性差和增殖差的问题，并且可以长期维持其形态和功能，这为大量制备功能成熟的小鼠角膜上皮细胞及其应用提供了可能。

【技术实现步骤摘要】
一种用于原代小鼠角膜上皮细胞体外培养的组合物及其用途
本专利技术属于细胞培养
，具体涉及一种用于原代小鼠角膜上皮细胞体外培养的组合物及其用途。
技术介绍
长期以来，原代小鼠角膜上皮细胞体外培养存在较大的困难，原因在于：一、贴壁性差；二、增殖性差；三、由于原代小鼠角膜上皮细胞在体外培养时容易发生上皮-间充质细胞转化(Epithelial-MesenchymalTransition，EMT)等多种因素，使得其难以长期维持其形态和功能。目前，常用的用于原代小鼠角膜上皮细胞体外培养的方法有：与小鼠成纤维细胞共培养；培养皿涂覆促吸附物质；加入单个促生长的小分子化合物等。但是，现有的方法只能部分地解决原代小鼠角膜上皮细胞体外培养的困难。因此，有必要对原代小鼠角膜上皮细胞的培养进行进一步研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种用于原代小鼠角膜上皮细胞体外培养的组合物及其用途，利用Forskolin、SB431542、DAPT、IWP-2、LDN-193189这5种小分子化合物与传统培养原代小鼠角膜上皮细胞的Rho-associatedkinase(ROCK)抑制剂Y27632联合使用，可以有效地解决原代小鼠角膜上皮细胞体外培养的贴壁性差和增殖差的问题，并且可以长期维持其形态和功能，这为大量制备功能成熟的小鼠角膜上皮细胞及其应用提供了可能。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案之一是：一种组合物，包括Forskolin、SB431542、DAPT、IWP-2、LDN-193189和Y27632。所述组合物用于原代小鼠角膜上皮细胞体外培养。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案之二是：一种上述的组合物在制备原代小鼠角膜上皮细胞体外培养用添加剂中的用途。所述用途中，所述组合物可以直接作为添加剂，添加至原代小鼠角膜上皮细胞的培养环境中使用。或者，该组合物也可与药学上可接受的辅料组合制备成添加剂，添加至原代小鼠角膜上皮细胞的培养环境中使用。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案中，Forskolin、SB431542、DAPT、IWP-2、LDN-193189、Y27632的摩尔比优选为18～22:9～11:4～6:0.4～0.6:0.05～0.15:9～11。优选地，所述Forskolin的浓度为18～22μmol/L。优选地，所述SB431542的浓度为9～11μmol/L。优选地，所述DAPT的浓度为4～6μmol/L。优选地，所述IWP-2的浓度为0.4～0.6μmol/L。优选地，所述LDN-193189的浓度为0.05～0.15μmol/L。优选地，所述Y27632的浓度为9～11μmol/L。优选地，所述组合物添加于培养基中，所述培养基为DermaLifeBasalMedium。本专利技术的组合物中，Forskolin为腺苷酸环化酶激活剂，可以下调EMT标记基因；SB431542可以抑制TGF-β信号通路；DAPT抑制Notch信号通路；IWP-2抑制Wnt信号通路；LDN-193189抑制BMP信号通路；Y27632抑制Rock信号通路。但相关的信号通路往往相互关联甚至相互抑制，因此本专利技术的组合物很可能并非通过单独的某个或某几个信号通路起效，初步推测本专利技术的组合物在小鼠角膜上皮细胞体外培养中可能的作用机制是通过综合调控多个信号通路进行，例如调控与EMT相关的多种信号通路等，调节与小鼠角膜上皮细胞相关的多种生长因子和转录调节因子等，促进细胞的增殖和功能的维持，且这种综合调控作用与本专利技术的组合物中各组分或其用量可能具有相关性。本专利技术的组合物中各组分发挥的作用是相辅相成的，单独的一种或几种效果不佳。本专利技术的组合物具有特异性，对原代小鼠角膜上皮细胞体外培养具有促进作用，但对包括角膜基质细胞、角膜内皮细胞、视网膜色素细胞、虹膜色素细胞等在内的多种眼部细胞的培养没有促进作用。此外，本专利技术的组合物还具有种属特异性，其主要对小鼠角膜上皮细胞培养有效，对兔角膜上皮细胞等无显著效果。本技术方案与
技术介绍
相比，它具有如下优点：本专利技术的组合物用于原代小鼠角膜上皮细胞体外培养，能够很好地促进小鼠角膜上皮细胞贴壁、增殖，以及维持其原有的功能和形态，这为大量制备功能成熟的小鼠角膜上皮细胞及其应用提供了可能，是一种良好的用于原代小鼠角膜上皮细胞体外培养的添加剂。附图说明下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明。图1为实施例1中原代小鼠角膜上皮细胞形态与结晶紫染色结果，其中A为显微镜下观察到的细胞形态，B为结晶紫染色结果，C为结晶紫染色结果的统计图，***表示P<0.01。图2为实施例2中对原代小鼠角膜上皮细胞进行Ki67免疫荧光染色结果，其中A为免疫荧光照片，B为A中免疫荧光染色结果的统计图，**表示P<0.05，***表示P<0.01。图3为实施例3中qRT-PCR检测原代小鼠角膜上皮细胞功能与分化相关基因表达结果，其中，A表示干细胞标志物p63、k14和分化标志物k12的表达结果，B表示上皮-间充质细胞转化标志物zeb1、zeb2、a-sma、b-catenin的表达结果，*表示P<0.05(与Ctrl组相比)，**表示P<0.05(与Ctrl组相比)，***表示P<0.05(与Ctrl组相比)。图4为实施例4中原代小鼠角膜上皮细胞长期培养形态变化图。图5为实施例5中原代兔角膜上皮细胞培养形态示意图。具体实施方式下面通过实施例具体说明本专利技术的内容：实施例1～5参照以下方法进行组合物的制备、细胞培养及分组：一、本专利技术的组合物及其配制：1、组合物中各组分(除有特别说明外，均购自Apexbio)的溶解：Forskolin：25mg，溶解于1.520mLDMSO中，浓度为40mmol/L。SB431542：10mg，溶解于1.300mLDMSO中，浓度为20mol/L。DAPT(即DAPT(GSI-IX))：10mg，溶解于1.156mLDMSO中，浓度为20mol/L。IWP-2：10mg，溶解于2.140mLDMSO中，浓度为10mol/L。LDN-193189：5mg，溶解于12.300mLDMSO中，浓度为1mol/L。Y27632：10mg，溶解于3.122mLDMSO中，浓度10mol/L。配制时，如有不溶解，置于37℃水浴加热10分钟或者置于超声波浴中震荡一段时间。分装，储存于-20℃。用时取出加入培养基中稀释至所需浓度。2、组合物的配制本实施例所用的培养基为DermaLifeBasalMedium，本专利技术的组合物在培养基中的终浓度为：Forskolin：20μmol/LSB431542：10μmol/LDAPT：5μmol/LIWP-2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种组合物，其特征在于：包括Forskolin、SB431542、DAPT、IWP-2、LDN-193189和Y27632。/n

【技术特征摘要】
1.一种组合物，其特征在于：包括Forskolin、SB431542、DAPT、IWP-2、LDN-193189和Y27632。


2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述Forskolin、SB431542、DAPT、IWP-2、LDN-193189、Y27632的摩尔比为18～22:9～11:4～6:0.4～0.6:0.05～0.15:9～11。


3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述Forskolin的浓度为18～22μmol/L。


4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述SB431542的浓度为9～11μmol/L。


5.根据权利要求1所述的组合物，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：李程，安小娅，薛玉花，徐雅洁，刘祖国，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35