小分子诱导人脂肪间充质干细胞分化为肝脏样细胞的方法技术

本发明专利技术公开了小分子诱导人脂肪间充质干细胞分化为肝脏样细胞的方法，诱导限定性内胚层细胞；从DE细胞诱导获得肝脏祖细胞；诱导获得肝脏成熟细胞。本发明专利技术的有益效果是hAD‑MSCs取材及体外培养条件成熟，可来自患者自身脂肪组织无伦理障碍避免异体细胞免疫排斥，其本身就无免疫原性，细胞增殖活性高；仅需15天左右就能获得具有肝细胞形态、基因表达和功能的iHeps，诱导过程快速高效，可成为临床治疗方案中肝细胞移植的稳定来源。

【技术实现步骤摘要】
小分子诱导人脂肪间充质干细胞分化为肝脏样细胞的方法
本专利技术属于干细胞与再生医学
，涉及一种化学小分子诱导人脂肪间充质干细胞分化为肝脏样细胞的方法。
技术介绍
各种致病因素，包括病毒感染、毒素、自身免疫缺陷和遗传性疾病等，都会损害肝功能，导致慢性肝病或急性肝功能衰竭。每年约有10％的终末期肝病患者在等待肝脏供体时死亡。原位肝移植(OLT)是治疗终末期肝病的有效手段，然而，OLT的使用受到供体缺乏、免疫抑制剂的副作用和伦理问题的限制。肝细胞移植和人工肝支持成为恢复肝功能的有效方法，提高了患者的生存率，但是这两种方法也因为有限的细胞来源和设备不足的而受到限制。肝细胞移植有助于功能衰竭的肝脏恢复功能。目前，很多研究都致力于寻找一种能够产生稳定的功能性肝细胞的可行性方法。随着干细胞领域快速发展，由干细胞分化的肝细胞样细胞逐渐成为体外致肝损伤药物筛选的新选择，细胞表型和功能蛋白表达与在体肝细胞相近，有望替代人原代肝细胞，成为临床肝脏疾病治疗的细胞产品。替代性干细胞来源，如多能干细胞，成纤维细胞，肝祖细胞，羊膜上皮细胞和间充质干细胞(MSC)，可用于体外诱导生成类肝细胞(HLCs)，诱导的类肝细胞(HLCs)的功能接近人类原代肝细胞。间充质干细胞(MSC)是一类自我更新的细胞，几乎存在于所有组织。作为诱导肝细胞的来源，源自脂肪、骨髓和羊膜的间充质干细胞由于具有三系分化能力，并且与免疫排斥和畸胎瘤形成相关的治疗风险较低而倍受关注。与源自骨髓和羊膜的MSC相比，脂肪来源的MSC(hADMSCs)更容易获得，代表了无争议的MSC来源。因此，hADMSCs是肝移植最有希望的替代细胞来源。通过添加特异性细胞因子可以使间充质干细胞诱导为肝脏样细胞，但是细胞因子比例组合和使用量不同会直接影响诱导效率，故现阶段使用特异性细胞因子诱导的肝脏样细胞功能有限且目标细胞得率低下。临床应用需要尽可能缩短体外诱导分化的时间，目前的技术诱导分化需要大约1个月的时间，使得这些诱导分化方法并不适用于实际临床应用。因此，开发新的能在短时间内将hADMSCs高效地诱导成为有功能的成熟肝细胞(iHeps)的方法是本领域的一个难题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供小分子诱导人脂肪间充质干细胞分化为肝脏样细胞的方法，解决了现有技术中存在的(1)原代肝细胞来源(2)体外诱导功能性肝细胞时间较长的问题。本专利技术的有益效果是：(1)hAD-MSCs取材及体外培养条件成熟，可来自患者自身脂肪组织无伦理障碍避免异体细胞免疫排斥，其本身就无免疫原性，细胞增殖活性高；(2)仅需15天左右就能获得具有肝细胞形态、基因表达和功能的iHeps，诱导过程快速高效，可成为临床治疗方案中肝细胞移植的稳定来源。本专利技术所采用的技术方案是按照以下步骤进行：1)诱导限定性内胚层细胞；2)从DE细胞诱导获得肝脏祖细胞；3)诱导获得肝脏成熟细胞。进一步，诱导限定性内胚层细胞方法如下：(1)选择第四代hAD-MSCs作为种子细胞，消化待用；(2)将实验组及对照组细胞接种于孔板中，加入hAD-MSCs培养基培养；(3)弃去培养基，用PBS洗一遍，加入含有DMSO并含血清F12-DMEM培养基，，诱导；(4)弃去含有DMSO的诱导培养基，用PBS洗一遍，加入含CHIR99021的含血清F12-DMEM培养基，诱导；(5)弃去含MCHIR99021的含血清F12-DMEM培养基，用PBS洗一遍，加入F12-DMEM培养基，诱导；(6)收集细胞样品，用多种分子手段检测标志基因Foxa2、Sox17表达情况。进一步，从DE细胞诱导获得肝脏祖细胞方法如下：(1)以第四代hAD-MSCs诱导获得的DE细胞作为种子细胞；(2)弃去F12-DMEM培养基，用PBS洗一遍，加入含有SB431542，sodiumbutyrate和DMSO的无血清F12-DMEM培养基；(3)每天全量换液一次诱导；(4)收集细胞样品，用不同方法检测Foxa2、ALB、HNF4α标志基因的表达情况。进一步，诱导获得肝脏成熟细胞方法如下：(1)诱导获得肝脏祖细胞后，弃去含有SB431542和sodiumbutyrate的无血清F12-DMEM培养基，用PBS洗一遍，加入含有FH1，FPH1，SB431542，dexamethasone和hydrocortisone的无血清F12-DMEM培养基；(2)每天全量换液一次，诱导；(3)收集细胞样品，用不同方法检测AFP、ALB、A1AT标志基因的表达情况。附图说明图1是本专利技术诱导后细胞形态图；图2是本专利技术诱导后肝脏细胞ALB免疫荧光染色结果图；图3是本专利技术诱导后肝脏细胞糖原染色结果图。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行详细说明。1.诱导限定性内胚层(DefinitiveEndoderm，DE)细胞(1)选择第四代hAD-MSCs人脂肪来源间充质干细胞作为种子细胞，消化待用；(2)将实验组及对照组细胞以5×105细胞/孔的密度接种于6孔板中，加入hAD-MSCs培养基至2ml/孔，培养24h；(3)弃去培养基，用PBS洗一遍，加入含有0.5％DMSO并含2％血清F12-DMEM杜氏改良Eagle培养基：营养混合物F-12培养基，2ml/孔，诱导24h；(4)弃去含有0.5％DMSO的诱导培养基，用PBS洗一遍，加入含CHIR99021(3μM)(C22H18Cl2N8)的含2％血清F12-DMEM培养基，2ml/孔,诱导24h；(5)弃去含3μMCHIR99021的含2％血清F12-DMEM培养基，用PBS洗一遍，加入F12-DMEM培养基，2ml/孔，诱导24h。(6)共培养3天后，收集细胞样品，用多种分子手段检测标志基因Foxa2、Sox17等表达情况。2.从DE细胞诱导获得肝脏祖(HepaticProgenitorcells)细胞(1)以第四代hAD-MSCs诱导获得的DE细胞作为种子细胞；(2)弃去F12-DMEM培养基，用PBS洗一遍，加SB431542(0.5μM)(C22H16N4O3)，sodiumbutyrate(250nM)(丁酸钠)和DMSO(总体积的0.5％)(二甲基亚砜)的无血清F12-DMEM培养基，2ml/孔；(3)每天全量换液一次，诱导7天；(4)共培养7天后，收集细胞样品，用不同方法检测Foxa2、ALB、HNF4α等标志基因的表达情况。3.诱导获得肝脏成熟细胞(Hepatocyte-likecells)(1)诱导获得肝脏祖细胞后，弃去含有SB431542(C22H16N4O3)和sodiumbutyrate(丁酸钠)的无血清F12-DMEM杜氏改良Eagle培养基：营养混合物F-12，用PBS洗一遍，加入含有FH1(15μM)(C17本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.小分子诱导人脂肪间充质干细胞分化为肝脏样细胞的方法，其特征在于按照以下步骤进行：/n1)诱导限定性内胚层细胞；/n2)从DE细胞诱导获得肝脏祖细胞；/n3)诱导获得肝脏成熟细胞。/n

【技术特征摘要】
1.小分子诱导人脂肪间充质干细胞分化为肝脏样细胞的方法，其特征在于按照以下步骤进行：
1)诱导限定性内胚层细胞；
2)从DE细胞诱导获得肝脏祖细胞；
3)诱导获得肝脏成熟细胞。


2.按照权利要求1所述小分子诱导人脂肪间充质干细胞分化为肝脏样细胞的方法，其特征在于：所述诱导限定性内胚层细胞方法如下：
(1)选择第四代hAD-MSCs作为种子细胞，消化待用；
(2)将实验组及对照组细胞接种于孔板中，加入hAD-MSCs培养基培养；
(3)弃去培养基，用PBS洗一遍，加入含有DMSO并含血清F12-DMEM培养基，，诱导；
(4)弃去含有DMSO的诱导培养基，用PBS洗一遍，加入含CHIR99021的含血清F12-DMEM培养基，诱导；
(5)弃去含CHIR99021的含血清F12-DMEM培养基，用PBS洗一遍，加入F12-DMEM培养基，诱导；
(6)收集细胞样品，用多种分子手段检测标志基因Foxa2、Sox17表达情况。


3.按照权利要求1所述小分子诱导人脂肪间充...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹侃，许杨，李霄霞，
申请(专利权)人：青岛大学，
类型：发明
国别省市：山东;37