一种体外诱导人脐带间充质干细胞分化为具有胰岛素分泌功能的类胰岛团的方法技术

本发明专利技术公开了一种体外诱导人脐带间充质干细胞分化为具有胰岛素分泌功能的类胰岛团的方法。所述方法为，将Uc‑MSCs细胞接种铺板使其12‑36小时后达到100％汇合度，再用PBS清洗，再加入胰酶消化，再加入分化培养基，培养即可。本发明专利技术所述方法只用一步法就可以高效快速地将人脐带间充质干细胞分化为具有体内外应答葡萄糖分泌胰岛素功能的类胰岛团(islet‑like clusters)。所提供的诱导方案，可为1型及中晚期2型糖尿病患者进行胰岛移植提供供体来源。

【技术实现步骤摘要】
一种体外诱导人脐带间充质干细胞分化为具有胰岛素分泌功能的类胰岛团的方法
本专利技术涉及细胞培养领域，尤其涉及一种体外诱导人脐带间充质干细胞分化为具有胰岛素分泌功能的类胰岛团的方法。
技术介绍
糖尿病分型中，以1型和2型糖尿病为主，其中1型糖尿病主要是由于自身免疫系统攻击胰腺β细胞导致机体无法合成胰岛素引起胰岛素绝对不足，而2型糖尿病主要是由于胰岛素抵抗和机体无法对胰岛素进行充分反应导致β细胞功能和结构破坏，引起胰岛素相对不足。在糖尿病的治疗策略中主要有以下几种方法：胰岛素和胰岛素类似物、胰岛素增敏剂、胰岛素促泌剂，这三类药物都只能对症治疗，无法从根本上治疗糖尿病；胰岛和整个胰腺组织的移植手术除了供体来源不足之外，还存在严重的免疫排斥反应；胚胎干细胞或诱导性的多能干细胞治疗方式存在多向分化的成瘤性风险；近年来，同样具有分化能力且免疫原性低的各种来源的间充质干细胞在疾病治疗中应用广泛，其中脐带间充质干细胞(Uc-MSCs)是来源于新生儿脐带的间充质干细胞，其来源广泛且易于获取。近年来，很多文献报导了体外诱导胚胎干细胞或间充质干细胞为类胰岛团的方法，然而大部分诱导方法步骤繁琐复杂、历时较长且分化效率不高(Bai,C.,etal.(2015)；Kroon,E.,etal.(2008)；Limbert,C.,etal.(2011)；Moshtagh,P.R.,etal.(2013)；Gao,F.,etal.(2008)；Sun,B.,etal.(2015))，有相关专利申请诱导脐带间充质干细胞分化为胰岛素分泌型细胞的培养基和方法，申请号为CN201710678107.5和CN201510814060.1，的两个专利申请中使用的方法也是多步诱导且分化培养基中需要包含细胞因子等多种诱导分化的物质，步骤繁杂，分化效率低，不利于临床应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种体外诱导人脐带间充质干细胞分化为具有胰岛素分泌功能的类胰岛团的方法。为实现上述目的，本专利技术提供一种体外诱导人脐带间充质干细胞分化为具有胰岛素分泌功能的类胰岛团的方法，其特征在于，所述方法为，将Uc-MSCs细胞接种铺板使其12-36小时后达到100％汇合度，再用PBS清洗，再加入胰酶消化，再加入分化培养基，培养即可。进一步，所述PBS为1xPBS；进一步，所述用PBS清洗的次数为2-4次；优选的，清洗的次数为2-3次。进一步，所述胰酶为0.05％-1％胰酶。进一步，所述分化培养基的体积比为DMEM/F-121:1+1％BSA+1xITS。进一步，所述诱导培养的时间为1-144小时。进一步，所述培养的条件为在37℃，95％湿度的CO2培养箱中培养。本专利技术所述方法只用一步法就可以高效快速地将人脐带间充质干细胞分化为具有体内外功能的类胰岛团(islet-likeclusters)。所提供的诱导方案，可为于1型及中晚期2型糖尿病患者进行胰岛移植提供供体来源。采用本专利技术的方法诱导后96小时，大部分细胞已经分化为类胰岛团，诱导后144小时，类胰岛团呈现淡黄色，分化效率95％-100％，DTZ染色结果显示该类胰岛团可以被DTZ(双硫腙)特异性地染成猩红色。显示诱导分化的类胰岛团中，胰岛特异性基因表达量明显上调。正常Uc-MSCs细胞在低糖(2.8mM葡萄糖)和高糖(16.7mM葡萄糖)刺激条件下分泌胰岛素量很低且无差异，而诱导分化后islet-likeclusters在高糖条件下胰岛素分泌明显增加。诱导分化的islet-likeclusters具有降低糖尿病小鼠血糖的效果，与假手术组(shamoperation)相比有显著性差异。表明利用本专利技术提供的诱导方法，可将人脐带间充质干细胞诱导分化为有功能的胰岛素分泌细胞，为临床进行胰岛移植提供工体来源。附图说明图1是体外诱导Uc-MSCs细胞分化后0、12、24、36、48、72、96、120、144小时的细胞形态图。图2是体外诱导Uc-MSCs细胞分化后胰岛特异性基因表达情况图。图3是体外诱导Uc-MSCs细胞分化后分化的islet-likeclusters(胰岛样细胞团)的体外功能实验图。图4是构建1型糖尿病小鼠模型胰腺组织H&E和IF染色结果图。图5是为肾包膜移植后小鼠肾组织(肾包膜下)H&E和IF染色结果图。图6是为肾包膜移植后小鼠血糖情况结果图。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1.细胞培养及诱导分化实验用含有10％胎牛血清的DMEM/F-121:1培养基培养人脐带间充质干细胞(Uc-MSCs)，诱导分化前一天，将Uc-MSCs细胞接种至12孔板中，使其第二天达到100％汇合度，去掉培养基，1xPBS清洗三次，加入300μl0.05％-1％胰酶，之后加入含1xITS和1％BSA的DMEM/F-121:1分化培养基，培养于37℃，95％湿度的培养箱中，定时观察细胞分化情况。实施例2.Uc-MSCs分化的类胰岛团的体外功能实验2.1双硫腙(1mg/mlDTZinDMSO)染色实验：细胞分化至第六天，加入DTZ使其终浓度为10ug/ml,放入培养箱约10分钟，显微镜下观察染色情况。在显微镜下观察诱导分化后0、12、24、36、48、72、96、120、144小时的细胞形态，如附图1所示，其中con代表未诱导分化时的细胞组，0、12、24、36、48、72、96、120、144hrs代表诱导分化后不同时间点(右上角的144hrs表示是在4X物镜下观察到的形态)，DTZStaining染色表示对诱导分化至144hrs的类胰岛团进行双硫腙染色(4X物镜)。其余均为10X物镜观察。从图1可以看出，在诱导后96小时，大部分细胞已经分化为类胰岛团，诱导后144小时，类胰岛团呈现淡黄色，分化效率95％-100％，DTZ染色结果显示该类胰岛团可以被特异性地染成猩红色。2.2PCR检测胰岛特异性基因表达情况：1)RNA提取：细胞分化至第六天，将细胞吸取至1.5mlEP管中，4℃，3000rpm离心5分钟，弃上清，加入1xPBS清洗，4℃，3000rpm离心5分钟，重复清洗一次，最终小心弃上清，在沉淀中加入Trizol400μl。室温下涡旋30秒，观察细胞完全裂解后，加入80μl氯仿，再涡旋30秒，室温放置5分钟，4℃，13000rpm离心15分钟，观察到样品分层。小心将上层水相转移至新的1.5mlEP管中，加入200μl预冷的异丙醇，摇匀后本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种体外诱导人脐带间充质干细胞分化为具有胰岛素分泌功能的类胰岛团的方法，其特征在于，所述方法为，将Uc-MSCs细胞接种铺板使其12-36小时后达到100％汇合度，再用PBS清洗，再加入胰酶消化，再加入分化培养基，培养即可。/n

【技术特征摘要】
1.一种体外诱导人脐带间充质干细胞分化为具有胰岛素分泌功能的类胰岛团的方法，其特征在于，所述方法为，将Uc-MSCs细胞接种铺板使其12-36小时后达到100％汇合度，再用PBS清洗，再加入胰酶消化，再加入分化培养基，培养即可。


2.权利要求1所述体外诱导人脐带间充质干细胞分化为具有胰岛素分泌功能的类胰岛团的方法，其特征在于，所述PBS为1xPBS。


3.权利要求1所述体外诱导人脐带间充质干细胞分化为具有胰岛素分泌功能的类胰岛团的方法，其特征在于，所述用PBS清洗的次数为2-4次；优选的，清洗的次数为2-3次。


4.权利要求1所述体外诱导人脐带间充质干...

【专利技术属性】
技术研发人员：李良成，黄飞榕，钱丽霞，
申请(专利权)人：厦门大学，博生众康厦门医药生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35