一种组合物及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种组合物及其应用，利用组合物制备培养基用于诱导人多能干细胞分化为肝前体细胞，本发明专利技术通过筛选活性组分，优化组分配比，向分化的细胞加入GSK3‑beta抑制剂、Nodal激活剂、BMP激活剂、BMP抑制剂和Hedgehog激活剂，诱导人多能干细胞分化为肝前体细胞，过程简洁高效，阳性细胞含量高，降低了细胞分化所需的成本，用于药物研发和再生医学治疗相关研究和应用，应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】
一种组合物及其应用
本专利技术属于生物
，涉及一种组合物及其应用，尤其涉及一种组合物及其用于制备诱导人多能干细胞分化为肝前体细胞的细胞培养基的用途。
技术介绍
肝脏是人体最大的器官和腺体，承担着重要的内分泌和外分泌功能。目前肝脏疾病有着较高的致病率和致死率。根据2014年的报道，全球的肝病患者多于13亿，而且我国的肝病患者多达3亿。肝脏疾病包括病毒性肝炎，酒精性脂肪肝炎和非酒精性脂肪肝炎。终末期的肝病(肝硬化，肝癌)是不可逆的。而且临床上，尚未发现有效药物治疗肝硬化和肝癌。以上原因导致了肝病致死率较高。目前，治疗终末期肝病的有效方法为肝移植。但是肝移植受限于供体的短缺和机体的免疫排斥反应。研究者主要采取两种手段，以减少来源短缺的问题。一方面，研究者使用肝细胞移植代替肝移植，使得操作更简单、使用的时机更灵活。然而，原代肝细胞不但难以在体外扩增，更是难以维持代谢功能。于是，研究者尝试使用干细胞来源的肝前体细胞(hepaticprogenitorcell)或者肝样细胞(hepatocyte-likecell)替代原代肝细胞，将其用于治疗肝损伤。其中，肝前体细胞具有增殖能力和肝胆双向分化的潜能。因此，移植肝前体细胞治疗肝脏疾病逐渐成为再生医学领域的研究热点。获取肝前体细胞主要包括以下方法：从肝脏中提取获得；将干细胞分化为肝前体细胞。受限于肝脏的来源短缺，难以获取到足够的原代肝前体细胞用于临床治疗。因为胚胎干细胞(embryonicstemcell，ESC)和诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcell，iPSC)具有无限增殖和多向分化的潜能，所以将其分化为肝前体细胞将能够解决来源短缺的问题。肝前体细胞的分化可分为两个阶段，定型内胚层诱导(definitiveendoderminduction，DEinduction)和肝特化阶段(hepaticdifferentiation)。定型内胚层的诱导过程中，Wnt，Activin/Nodal，PI3K等信号通路起着关键的调控作用。肝特化阶段主要依赖于BMP和FGF信号通路。虽然使用生长因子将干细胞分化为肝前体细胞的技术已日渐完善，但是生长因子的大量使用使得分化的成本高昂。此外，生长因子在长期存放的过程中容易失活，影响实验的可重复性。以上原因阻碍了干细胞来源的肝前体细胞在临床的大量使用。因此，本领域亟需建立一种新的、高效的、基于小分子化合物的分化方案，降低干细胞分化为肝前体细胞的成本。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供一种组合物及其应用，通过向分化的细胞加入所述组合物，诱导人多能干细胞分化为肝前体细胞，简洁高效快速，降低了细胞分化所需的成本，可用于药物研发和再生医学治疗相关研究和应用，应用前景广阔。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种组合物，所述组合物包括基础培养基，所述组合物还包括GSK3-beta抑制剂、Nodal激活剂、BMP激活剂、BMP抑制剂、Hedgehog激活剂或血清替代物中的任意一种或至少两种的组合。本专利技术中，专利技术人在长期科研实践过程中，为解决现有技术诱导人多能干细胞分化肝前体细胞的缺点，通过筛选活性组分，优化组分配比，向分化的细胞加入GSK3-beta抑制剂，Nodal激活剂，BMP激活剂，BMP抑制剂，Hedgehog激活剂，诱导人多能干细胞分化为肝前体细胞，过程简洁高效，阳性细胞含量高，降低了细胞分化所需的成本，用于药物研发和再生医学治疗相关研究和应用，应用前景广阔。优选地，所述基础培养基包括RPMI1640、Dulbecco'sModifiedEagleMedium、Ham’sF12、DMEM/F12、Ham'sF-12KMedium，HepatoZYME-SFM、William’sEMedium、Waymouth’sMedium或HepatocyteCultureMedium中的任意一种或至少两种的组合。优选地，所述GSK3-beta抑制剂包括CHIR99021HCL、CHIR99021或BIO中的任意一种或至少两种的组合，优选为CHIR99021HCL。优选地，所述CHIR99021HCL的浓度为0.5-4.5μM，例如可以是0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM或4.5μM。最终培养基中CHIR99021HCL的浓度为0.5-4.5μM，例如可以是0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM或4.5μM。优选地，所述Nodal激活剂包括IDE1和/或IDE2。优选地，所述IDE1的浓度为0.5-4μM，例如可以是0.5μM、1μM、2μM、3μM或4μM。最终培养基中IDE1的浓度为0.5-4μM，例如可以是0.5μM、1μM、2μM、3μM或4μM。优选地，所述BMP激活剂包括异甘草素、4-羟基查耳酮或kartogenin中的任意一种或至少两种的组合。优选地，所述BMP激活剂的浓度为1-20μM，例如可以是1μM、2μM、4μM、6μM、8μM、10μM、12μM、14μM、16μM、18μM或20μM。最终培养基中4-羟基查耳酮的浓度为1-20μM，例如可以是1μM、2μM、4μM、6μM、8μM、10μM、12μM、14μM、16μM、18μM或20μM。优选地，所述BMP抑制剂包括dorsomorphin2HCl、dorsomorphin或LDN-193189中的任意一种或至少两种的组合。优选地，所述BMP抑制剂dorsomorphin2HCl的浓度为0-1μM，例如可以是0μM、0.2μM、0.4μM、0.6μM、0.8μM或1μM。最终培养基中dorsomorphin2HCl浓度为0-1μM，例如可以是0μM、0.2μM、0.4μM、0.6μM、0.8μM或1μM。优选地，所述Hedgehog激活剂包括SmoothenedAgonistHCl；优选地，所述Hedgehog激活剂的浓度为0.2-1μM，例如可以是0.2μM、0.4μM、0.6μM、0.8μM或1μM。最终培养基中SmoothenedAgonistHCl浓度为0.2-1μM，例如可以是0.2μM、0.4μM、0.6μM、0.8μM或1μM。优选地，所述血清替代物包括不含胰岛素的B27和/或含胰岛素的B27。优选地，所述血清替代物的体积浓度为0-3％，例如可以是0％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％或3％。最终培养基中使用的小分子化合物见表1。表1小分子化合物的中英文名称及其CAS编号第二方面，本专利技术提供一种如第一方面所述的组合物用于制备诱导人多能干细胞分化为肝前体细胞的细胞培养基的用途。优选地，所述人多能干细胞包括人胚胎干细胞系和人诱导多能干细胞系。优选地，所述人胚胎干细胞系包括WA01(H1)和/或WA09(H9)。优选地，所述人诱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种组合物，所述组合物包括基础培养基，其特征在于，所述组合物还包括GSK3-beta抑制剂、Nodal激活剂、BMP激活剂、BMP抑制剂、Hedgehog激活剂或血清替代物中的任意一种或至少两种的组合。/n

【技术特征摘要】
1.一种组合物，所述组合物包括基础培养基，其特征在于，所述组合物还包括GSK3-beta抑制剂、Nodal激活剂、BMP激活剂、BMP抑制剂、Hedgehog激活剂或血清替代物中的任意一种或至少两种的组合。


2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述基础培养基包括RPMI1640、Dulbecco'sModifiedEagleMedium、Ham’sF12、DMEM/F12、Ham'sF-12KMedium，HepatoZYME-SFM、William’sEMedium、Waymouth’sMedium或HepatocyteCultureMedium中的任意一种或至少两种的组合。


3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述GSK3-beta抑制剂包括CHIR99021HCL、CHIR99021或BIO中的任意一种或至少两种的组合，优选为CHIR99021HCL；
优选地，所述CHIR99021HCL的浓度为0.5-4.5μM；
优选地，所述Nodal激活剂包括IDE1和/或IDE2；
优选地，所述IDE1的浓度为0.5-4μM；
优选地，所述BMP激活剂包括异甘草素、4-羟基查耳酮或kartogenin中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述BMP激活剂的浓度为1-20μM。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其特征在于，所述BMP抑制剂包括dorsomorphin2HCl、dorsomorphin或LDN-193189中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述BMP抑制剂dorsomorphin2HCl的浓度为0-1μM；
优选地，所述Hedgehog激活剂包括SmoothenedAgonistHCl；
优选地，所述Hedgehog激活剂的浓度为0.2-1μM；
优选地，所述血清替代物包括不含胰岛素的B27和/或含胰岛素的B27；
优选地，所述血清替代物的体积浓度为0％-3％。


5.一种如权利要求1-4中任一项所述的组合物用于制备诱导人多能干细胞分化为肝前体细胞的细胞培养基的用途。


6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述人多能干细胞包括人胚胎干细胞系和人诱导多...

【专利技术属性】
技术研发人员：李尹雄，庄苑琦，潘廷才，陈彦，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44