一种泛性型惰性载体沙门氏菌及其潜在应用制造技术

本发明专利技术公开了泛性型惰性载体沙门氏菌S9H及其潜在应用。泛性型惰性载体沙门氏菌S9H是由惰性载体菌S9使用LB固体和液体培养基连续在体外培养传代至第四十代获得，在工作浓度细菌数量下能与人源、鼠源、牛源、猪源和禽源（包括鸡、鸭、鹅、火鸡、鸽子、鹌鹑）血清和全血都不发生非特异性凝集反应，且具有携带和表面表达展呈人源、鼠源、牛源、猪源和禽源（包括鸡、鸭、鹅、火鸡、鸽子、鹌鹑）不同抗原因子的特性，可应用于简便快速检测人和多种类动物抗原或感染抗体的间接凝集试验检测方法的开发，改进和完善现有凝集抗原抗体检测的凝集试验的特异性、敏感性不佳的技术瓶颈，具有广泛的应用价值和市场前景。

【技术实现步骤摘要】
一种泛性型惰性载体沙门氏菌及其潜在应用
本专利技术属于生物医学技术检测领域，具体涉及一种泛性型惰性载体沙门氏菌及其潜在应用，该泛性型惰性载体沙门氏菌能在工作浓度细菌数量下与人源、鼠源、牛源、猪源和禽源(包括鸡、鸭、鹅、火鸡、鸽子、鹌鹑)不同遗传背景人和多种类动物血清和全血都不发生非特异性凝集反应。
技术介绍
在疫病防控和流行病学研究中，血清学检测技术经常被用来诊断动物是否感染或携带某种特定病原体，其中凝集试验是医学、兽医临床一直广泛使用的一种经典型血清学快速诊断方法。凝集试验的原理是细菌颗粒性抗原在电解质存在和温度适宜的条件下，结合相应的血清抗体后，数分钟内出现凝集、凝聚现象，形成凝集小块或颗粒，仅需通过肉眼就能观察和判定反应结果。我们将参与反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。平板凝集试验是凝集反应中应用较为广泛的一种定性方法，将诊断血清(含有已知抗体)与待检菌悬液各滴一滴于洁净的透明玻璃平板上，等量(体积)轻轻混匀后，室温等待2分钟内，如出现肉眼可见的颗粒状凝集，即为阳性凝集反应，常用于细菌的鉴定和抗原的分型等。相反，也可用已知的诊断抗原来检测待检血清或全血中是否存在相应抗体，医学和兽医临床上常用于布氏杆菌感染诊断的玻板凝集反应和鸡白痢/禽伤寒沙门氏菌全血平板凝集试验等。鉴于全血平板凝集试验一直作为现场快速检测方法，其操作简便——只需要现场采集的一滴全血加一滴凝集抗原轻轻晃动混匀玻板，且两分钟内通过肉眼观察判定反应结果；成本低廉——单份样本的直接检测的生产成本0.1元左右，且不需要任何额外的检测设备，更不需要昂贵的实验室仪器设备就能完成现场监测、检测。由于其上述优点，全血平板凝集试验一直广泛地应用在种禽生产中的种源性疾病监测检测，如在鸡白痢感染的检测和净化工作中，全血平板凝集试验一直作为代表性经典凝集试验在大规模鸡群中快速筛查鸡白痢感染(抗体)，由于其在鸡舍内圈栏旁检测的便捷性和实用性，具有无可比拟的临床应用优势，在美国国家家禽改良计划鸡白痢净化工作中发挥了重要作用。但是必须注意到全菌抗原复杂性的弊端和菌体O抗原靶向抗体的检测技术敏感性不佳瓶颈。事实上，该凝集抗原检测在实践应用中有一定的局限性，有报道凝集诊断抗原存在多种非特异性交叉反应，各批次检测结果不稳定和重复性结果不佳，反应中弱阳性结果难以判定和敏感性不佳出现漏检等多种因素影响检测结果，同时考虑到该菌体抗原寡糖，抗原性弱，且O抗原的O1、O9、O12三种成分中，其中O12出现三种变异株，鸡白痢沙门氏菌存在标准型、变异型和中间型，导致诊断抗原菌株与感染血清的特异匹配反应不强，尤其注意到菌体O抗原空间构象障碍，抗原展呈受限，存在O不凝集性，因而该凝集诊断法检测的敏感性不高，仅对感染成年鸡群检测效果相对敏感，通常需要在种鸡产蛋期间检测和净化，而对雏鸡感染抗体检测由于敏感性受限则可能存在较大漏检检测误差和各批次检测结果不一致。前期研究中，申请人使用目前临床应用最广泛的商品化鸡白痢/禽伤寒沙门氏菌染色凝集抗原，分两次在不同时间检测同一批来自某鸡场200份血清时发现，两批的检测结果总符合率仅为81％，提示两次检测结果并不稳定和前后一致性并不理想。当与荷兰BioChek公司的沙门氏菌D群ELISA试剂盒对比检测结果时发现，检测结果总符合率仅为79.5％，阳性符合率(检出率或敏感性)为75.2-79.4％，阴性符合率为79.5-85.5％。上述检测结果和比较分析表明该商品化凝集抗原检测鸡白痢/禽伤寒沙门氏菌感染血清抗体时，敏感性、特异性、重复稳定性和结果准确性均未达到较为理想的水平，提示目前商品化凝集抗原的检测结果存在一定程度或有时较为明显的假阳性错检和假阴性漏检，表明凝集抗原检测结果的准确度有待进一步提高，其根本原因在于目前应用于凝集试验的凝集抗原都为细菌的全菌抗原，为复合多种不同成分的细菌颗粒抗原，而非单一O1、O9、O12菌体抗原。理论上说，这种多成分的全菌抗原会与同科属、其他科属种细菌(尤其在肠杆菌科内)存在同源和相同成分，反映在一定程度上产生非特异性交叉反应。且值得注意的是，鉴于凝集抗原的工作浓度需含较高浓度的细菌数量和导致非特异性交叉反应影响，该非特异性交叉反应弊端必然会影响甚至较为显著干扰检测和诊断结果，从而严重影响疫病净化效果和疫病净化工作进程的推进。在前期研究中，申请人研究的惰性载体菌S9菌在一定浓度范围内仅仅对不同背景的鸡血清具备不凝集的功能，而对其他动物可能存在不同程度凝集情况，因此，其惰性载体菌S9菌仅仅只能用于开发鸡凝集实验及其应用，其应用具备一定的局限性。综上所述，基于鸡白痢沙门氏菌全菌抗原凝集试验的非特异性交叉反应和菌体O抗原靶向抗体检测的敏感性局限，为提高特异和敏感准确性，则很有迫切性和必要性研发出替代现有经典凝集试验的检测系统，但其前提是研发出与人等多种动物来源背景的血清和全血都不发生非特异性凝集反应的一种泛性型惰性载体菌，且这种泛性型惰性载体菌能携带和表面表达展呈单一抗原因子并特异靶向不同的病原菌感染(抗体)，如鸡白痢沙门氏菌感染(抗体)，用这种泛性惰性载体菌替代鸡白痢沙门氏菌全菌抗原作为凝集抗原，在保留凝集反应结果直观快速、操作简便、现场检测等优势的前提下，能精确和针对性提高凝集抗原反应的特异性、敏感性，以这种泛性惰性载体菌为载体的凝集试验能完善鸡白痢/伤寒监测检测和净化工作。这种泛性惰性载体菌为载体能够开发特异靶向不同病原菌感染(抗体)，这种新颖的凝集抗原试验的监测检测方法，在人类和许多动物疾病的诊断检测中都有非常巨大的潜在应用前景。
技术实现思路
专利技术目的：针对目前人类和动物疾病诊断检测领域广泛使用的凝集试验特异性、敏感性、重复稳定性和检测结果准确性有待提高和完善，且非常迫切需要，因此，专利技术人把惰性载体沙门氏菌S9使用LB琼脂和液体培养基交替培养40代开始，获得了一株具有泛性型惰性载体特征的沙门氏菌S9H，该泛性型惰性载体菌特征表现为在工作浓度细菌数量下与人源和多种动物包括鼠源、牛源、猪源和禽源等血清和全血都不发生非特异性凝集反应，并且能够表面表达展呈并携带特定抗原因子，靶向特异性感染抗体，因而可作为一种泛性型惰性载体菌应用于现场快速监测、检测感染人和多种动物抗体的间接凝集试验的开发，具有广泛的潜在应用前景。该泛性型惰性载体沙门氏菌S9H与S9菌不同之处在于，对多种不同动物具备不凝集的功能，因此，其被称为泛型惰性载体，其应用范围将更为广泛。技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种泛性型惰性载体沙门氏菌，所述泛性型惰性载体沙门氏菌是由惰性载体菌S9使用LB液体和固体培养基连续在体外培养传代至第四十代及以上获得的菌株命名为泛性型惰性载体沙门氏菌S9H，第四十代至六十代，它们具有同样的泛性型惰性载体特性。本
技术实现思路
还包括所述的泛性型惰性载体沙门氏菌的获得方法，包括以下步骤：将泛性型惰性载体沙门氏菌是由惰性载体菌S9使用LB液体和固体培养基连续在体外培养传代至第四十代及以上获得的菌株。本专利技术的泛性型惰性载体沙门氏菌S9H能在LB或XLD琼脂培养基中培养，培养方法如下：从保存的菌种中挑取少量划线本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种泛性型惰性载体沙门氏菌，其特征在于，所述泛性型惰性载体沙门氏菌是由惰性载体菌S9使用LB液体和固体培养基连续在体外培养传代至第四十代及以上，将第四十代及以上获得的菌株命名为泛性型惰性载体S9H。/n

【技术特征摘要】
1.一种泛性型惰性载体沙门氏菌，其特征在于，所述泛性型惰性载体沙门氏菌是由惰性载体菌S9使用LB液体和固体培养基连续在体外培养传代至第四十代及以上，将第四十代及以上获得的菌株命名为泛性型惰性载体S9H。


2.权利要求1所述的泛性型惰性载体沙门氏菌的获得方法，其特征在于，所述获得方法步骤如下：所述泛性型惰性载体沙门氏菌是由惰性载体菌S9使用LB液体和固体培养基连续在体外培养传代至第四十代及以上获得的菌株。


3.一种泛性型惰性载体间接凝集试验检测系统，其特征在于，所述检测系统是包括权利要求1所述的泛性型惰性载体沙门氏菌和能在其菌体表面展呈表达并携带特定抗原因子的复合体。


4.根据权利要求3所述的检测系统，其特征在于，所述特定抗原因子为禽源沙门氏菌P因子、猪源大肠杆菌K88ac抗原因子、牛源大肠杆菌K99抗原因子或人源沙门氏菌I抗原因子中的一种或几种。


5.权利要求3或4所述的泛性型惰性载体间接凝集试验检测系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）特定抗原因子的编码基因的获得；
2）特定抗原因子的编码基因与质粒的连接获得重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱国强，杨斌，羊扬，孟霞，夏芃芃，段强德，朱晓芳，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32