一株可以共利用葡萄糖和木糖的丙酮丁醇梭菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株可以共利用葡萄糖和木糖的丙酮丁醇梭菌及其应用，其分类命名为丙酮丁醇梭菌（

【技术实现步骤摘要】
一株可以共利用葡萄糖和木糖的丙酮丁醇梭菌及其应用
本专利技术属于微生物
，具体涉及一株可以共利用葡萄糖和木糖的丙酮丁醇梭菌。
技术介绍
正丁醇一种无色、有酒气味的液体，沸点117.7℃，稍溶于水,是多种涂料的溶剂和制增塑剂邻苯二甲酸二丁酯（见邻苯二甲酸酯）的原料，也用于制造丙烯酸丁酯、醋酸丁酯、乙二醇丁醚以及作为有机合成中间体和生物化学药的萃取剂，还用于制造表面活性剂。丁醇因其优越的燃烧性能成为目前最具研发前景的生物燃料之一。作为燃料，丁醇具有能量密度大，可直接用于内燃机，运输方便等优点。在能源危机日益严峻的今天，丁醇作为燃料有着广阔的发展前景。目前，丁醇主要通过化学法合成，随着石油资源加速枯竭和价格飞涨，发酵法生产丁醇受到广泛重视。传统发酵法生成丁醇主要以粮食和或其他淀粉质农副产品为原料，但这些原料成本较高，同时会出现与民争粮的问题。近年来，国内外对木质纤维素为原料发酵产丁醇的研究很多。木质纤维原料中的六碳糖主要是葡萄糖(纤维素的主要组分)，五碳糖主要是木糖以及阿拉伯糖(半纤维素的主要组分)。其中，葡萄糖是最主要成分，其次为木糖，阿拉伯糖的含量较少。微生物在利用复杂碳源过程中普遍存在CCR（Carboncataboliterepression）效应，即速效碳源的快速利用对非速效碳源的代谢产生抑制作用。这一现象在产溶剂梭菌发酵木质纤维素水解液过程中同样存在。换言之，水解液中同时存在的葡萄糖抑制了细胞对其他糖源(木糖、阿拉伯糖等五碳糖)的有效利用，降低了物料转化效率和发酵的经济性。因此，解除产溶剂梭菌中的CCR效应、实现其对五碳糖和六碳糖的同等利用是利用木质纤维素为底物进行发酵的重要问题。共用五碳糖和六碳糖是提高丙酮丁醇菌株发酵效率的一个关键科学问题。
技术实现思路
专利技术目的：为了解决现有丙酮丁醇梭菌中的CCR效应，本专利技术提供了一种丙酮丁醇梭菌，本专利技术进一步提供了丙酮丁醇梭菌在发酵生产丁醇中的应用。技术方案：本专利技术所述一种丙酮丁醇梭菌，其分类命名为丙酮丁醇梭菌（Clostridiumacetobutylicum）LY4,已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2019年12月20日，保藏编号为CCTCCM20191081，保藏地址为中国湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学.邮编430072。该菌株是专利技术人于2018年9月11日对南京工业大学镜湖土壤进行筛选，用葡萄糖和木糖混糖为底物添加到培养基中进行筛选，在平板上划线纯化5-7代，筛选出能够利用葡萄糖和木糖混糖的菌株，并对筛选到的菌株进行厌氧培养，并用液相检测每天对葡萄糖、木糖的消耗情况。LY4生长及代谢特性：菌株LY4可以在37℃很好的生长，在pH5.0-6.0下生长良好。菌株特征：一种革兰染色阳性菌、细胞呈梭状、细胞大小(0.6-0.9)μm*(2.4-4.7)μm,常含细菌淀粉粒,以周生鞭毛运动，表面菌落圆形、突起,直径3-5mm。菌株LY4的16SrDNA的核酸序列如序列表中SEQIDNO:1所示。本专利技术进一步提供了丙酮丁醇梭菌LY4在发酵生产丁醇中的应用。优选地，丙酮丁醇梭菌LY4共利用葡萄糖和木糖作为碳源，发酵生产丁醇。本专利技术所述的ClostridiumacetobutylicumLY4可以单独利用葡萄糖，也可以单独利用木糖，当以混糖为底物时，在葡萄糖生成乙酰辅酶A进入三羧酸循环的同时，可以通过木糖异构酶和木酮糖激酶的作用得到3-P甘油醛，从而进入三羧酸循环，再经过一系列酶的催化得到乙酸、乙醇、丁酸、丁醇等产物。菌株LY4的高木糖利用能力归因于其高木糖异构酶（0.99U/mg蛋白）和木酮糖激酶（1.15U/mg蛋白）活性。一种含有本专利技术所述的可以共利用葡萄糖和木糖生产丁醇的菌株ClostridiumacetobutylicumLY416SrDNA序列的克隆载体。所述重组克隆载体，优选出发载体为pMD19T。含所述的菌株ClostridiumacetobutylicumLY416SrDNA序列的基因组工程菌EscherichcoilDH5α构建方法：利用引物27F：5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3,和1492R：5，-TACCTTGTTACGACTT-3,扩增菌株的LY416SrDNA，通过T/A克隆的方式连接至克隆载体pMD19T，构建重组克隆载体pMD19T-16S，将其转化到克隆宿主菌EscherichcoilDH5α，获得重组微生物EscherichcoilDH5α（pMD19T-16S），将所获得的重组微生物外源片段进行测序，NCBI数据库比对该16SrDNA序列，在分子水平将菌株LY4鉴定至Clostridiumacetobutylicum菌属。本专利技术所述菌株LY4通过基因组测序，发现其中含有木糖异构酶和木酮糖激酶以及一系列丁醇代谢途径所需要的酶，均可以进行重组克隆，进行异源表达。木糖主要通过木糖异构酶和木酮糖激酶的作用得到3-P甘油醛，从而进入三羧酸循环，再经过一系列酶的催化得到乙酸、乙醇、丁酸、丁醇等产物。上述菌株共利用葡萄糖和木糖发酵生产丁醇的应用也在本专利技术的保护范围之内。具体的应用方法为，将菌株LY4以接种量1%-10%v/v接种到发酵培养基中，37℃震荡培养，每隔24h，调pH至5.0-6.0（优选5.5），发酵72-168h（优选96h）。其中所述发酵培养基配方为NaCl1-1.5g/L,KH2PO40.5-1.0g/L,K2HPO40.5-1.0g/L,酵母粉2-4g/L,CaCl2·2H2O0.01-0.02g/L,FeCl2·4H2O1.0-2.0g/L,KCl0.1-0.4g/L,调节pH至5.0-6.0，碳源20-90g/L。其中所述的碳源为葡萄糖和木糖的混糖。葡萄糖和木糖的比例关系可以为任意比例，优选为1：1，1：2，2：1。有益效果：本专利技术以南京工业大学镜湖的土壤为分离材料，通过一系列的筛选分离纯化得到一株可以共利用葡萄糖、木糖混糖的菌株ClostridiumacetobutylicumLY4，在中温厌氧条件下发酵生产得到丁醇。菌株LY4在4-8天时间可基本利用50g/L的葡萄糖和木糖的混糖（混合比例1：1）。该菌不存在CCR效应，可以实现葡萄糖和木糖的共利用。为工业生产丁醇，实现对五碳糖和六碳糖的同等利用，具有重要意义。在木质纤维素制备丁醇中具有重要应用价值。附图说明图1为以60g/L混糖（葡萄糖和木糖1：1）为碳源条件下糖耗情况；图2为以60g/L混糖（葡萄糖和木糖1：1）为碳源条件下不同产物的产量；图3为以60g/L混糖（葡萄糖和木糖1：2）为碳源条件下糖耗情况；图4为以60g/L混糖（葡萄糖和木糖1：2）为碳源条件下不同产物的产量；图5为以60g/L混糖（葡萄糖和木糖2：1）为碳源条件下丁醇的产量；图6为以60g/L混糖（葡萄糖和木糖2：1）为碳源条件下不同产物的产量；图7为培养2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株可以共利用葡萄糖和木糖的丙酮丁醇梭菌，其分类命名为丙酮丁醇梭菌（

【技术特征摘要】
1.一株可以共利用葡萄糖和木糖的丙酮丁醇梭菌，其分类命名为丙酮丁醇梭菌（Clostridiumacetobutylicum）LY4，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为（CCTCCM20191081）。


2.根据权利要求1所述的丙酮丁醇梭菌的16SrDNA的核酸序列如序列表SEQIDNO:1所示。


3.权利要求1所述的丙酮丁醇梭菌在发酵生产丁醇中的应用。


4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将丙酮丁醇梭菌LY4以接种量5-10%体积比接种到发酵培养基中，震荡培养，每隔12-24h调节pH至5.0-6.0，发酵72-168h。


5.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：信丰学，姜岷，吕阳，蒋羽佳，董维亮，章文明，方艳，马江锋，周杰，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32