一种不同硬度的体外细胞培养基底材料聚丙烯酰胺凝胶薄膜的大批量制作方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种不同硬度的体外细胞培养基底材料聚丙烯酰胺凝胶薄膜的大批量制作方法，通过将凝胶溶液滴加在疏水玻璃载片和柔性塑料薄膜支撑物亲水面之间，使其沉积时共价结合PA凝胶。一旦PA凝胶片沉积并永久固定在柔性塑料支撑上，就能实现处理任何厚度或硬度的凝胶，将其切割成任何所需任何形状及大小，广泛应用在刚度依赖性细胞反应的体外培养中。本方法不但可以大批量生产定制各种尺寸的PA凝胶薄膜，还消除了使用PA粘合剂溶液预处理玻璃表面（玻璃盖玻片或昂贵的玻璃底多孔板的孔）的必要性，大大精简了研究步骤及研究时间，同时均匀的PA凝胶片可以脱水储存数月。

【技术实现步骤摘要】
一种不同硬度的体外细胞培养基底材料聚丙烯酰胺凝胶薄膜的大批量制作方法与应用
本专利技术属于生物工程水凝胶
，尤其涉及一种不同硬度的体外细胞培养基底材料聚丙烯酰胺凝胶薄膜的大批量制作方法与应用。
技术介绍
目前，大多数体外细胞研究是在聚苯乙烯刚性组织培养板(TCP)上进行的，其杨氏模量为～1GPa，然而，体内的大多数组织是软粘弹性材料，其模量从大脑的0.1kPa到骨软骨的100kPa，越来越多的研究发现基底硬度影响了细胞对环境的反应方式，甚至改变细胞的命运，因此开发跨越宽范围刚度的水凝胶材料以作为细胞体外培养的基底是生物工程
的研究热点。已开发出的多种水凝胶包括聚丙烯酰胺(PA)，聚乙二醇(PEG)，聚二甲基硅氧烷(PDMS)和藻酸盐，用以帮助理解研究刚度依赖性细胞。虽然基质硬度对细胞命运有重大影响的证据正在增长，但目前大部分水凝胶制备过程冗长、繁琐，仅适用于小批量生产，导致研究样本仅限于小规模。即使已经开发的几种高通量水凝胶技术，包括基于聚乙二醇PEG的微阵列，用于生产琼脂糖水凝胶微珠的微流体装置，或刚度由直径和高度调节的微米和纳米棒，因制备这类基材的技术是复杂的，且需要专业设备，仅可用于有限数量的实验室。聚丙烯酰胺凝胶(PA凝胶)不仅廉价且易于实施，而且还表现出生理学相关的杨氏模量范围，即0.3-300kPa，可覆盖体内所有软组织的硬度范围，已是广大生物工程研究首选的水凝胶。但现有的制备细胞培养PA凝胶的方法是劳动密集型的，需按需求逐一单独制作，仅限于小批量制备。国际上已有几个研究小组已经尝试大批量生产用于细胞培养的PA凝胶。有研究尝试制备厚的PA凝胶片，用打孔器“切割”并放入96孔板中，然而这种方法仅限于较硬的凝胶，即杨氏模量>1kPa，因为较软的凝胶是“粘性的”，难以直接切割，极易损坏。也有研究开发了一种更复杂的技术，通过将凝胶溶液倒入功能化的玻璃底板并通过用定制的盖玻片“夹住”它们，使凝胶可以在玻璃底多孔板中直接聚合，即使目前非常有希望，这种技术仍然可以观察到轻微的边缘效应，即凝胶形成在玻璃底多孔板中聚合，当移除玻璃底板使用水凝胶时边缘会形成皱褶，影响使用。此外，该技术需要定制设计的阵列，许多实验室不能直接采用，且需要昂贵的玻璃底多孔板，仍不适合大样本研究。为解决上述问题，本专利技术提供了一种通过利用永久柔性塑料薄膜作为凝胶结构支撑物的制备方法，能够制备、定制包括多孔板在内的多种形式的聚丙烯酰胺凝胶薄膜，使其成为硬度可变的体外细胞培养基底。该制作方法比现有方法更快捷，更有效，成本更低，并且允许大批量制备所需定制尺寸的凝胶薄膜，干燥后易于储存及运输，使用时达水合平衡后也可满足细胞贴壁生长，同时由于它不需要任何专门的设备，任何研究实验室都可以很容易地采用该方法制作体外细胞培养基底，将其广泛应用于刚度依赖性细胞反应的系列研究中。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种不同硬度的体外细胞培养基底材料聚丙烯酰胺凝胶薄膜的大批量制作方法，其操作简便、快捷有效、适合大批量制备所需定制尺寸且经济成本低，制成的聚丙烯酰胺凝胶薄膜干燥后易于储存及运输，使用时达水合平衡后的聚丙烯酰胺凝胶也可满足细胞贴壁生长，降低了研究细胞力学的复杂性，有利于细胞力学性质的相关研究进行。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种不同硬度的体外细胞培养基底材料聚丙烯酰胺凝胶薄膜的大批量制作方法，包括以下步骤：(1)制备丙烯酰胺溶液、双丙烯酰胺溶液、过硫酸铵水溶液，备用；(2)制备疏水玻璃载玻片和疏水柔性塑料薄膜支撑物，备用；(3)丙烯酰胺溶液和双丙烯酰胺溶液脱气，加入过硫酸铵水溶液、N，N，N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)，混合，得凝胶溶液；(4)疏水玻璃载玻片作为底部，硅树脂隔离物在疏水玻璃载玻片外缘做四周支撑，滴加凝胶溶液；然后将柔性塑料薄膜支撑物亲水面平铺于凝胶溶液上，将疏水玻璃载玻片覆盖在柔性塑料薄膜支撑物上，干燥聚合。所述丙烯酰胺溶液40％w/v；所述双丙烯酰胺溶液2％w/v；所述过硫酸铵水溶液10％w/v。所述干燥聚合，可以为室温静置干燥聚合、对流干燥聚合或加热干燥聚合。所述干燥聚合后，剥离柔性塑料薄膜支撑物。所述聚丙烯酰胺凝胶薄膜作为不同硬度的体外细胞培养基底材料的用途。所述聚丙烯酰胺凝胶薄膜在不同硬度的体外细胞培养基底材料中的使用方法，包括以下步骤：(1)聚丙烯酰胺凝胶薄膜制备成细胞培养皿所适应尺寸，备用；(2)培养皿中放置PDMS，然后放入备用的聚丙烯酰胺凝胶薄膜，凝胶面向上，室温静置至聚丙烯酰胺凝胶薄膜粘合到培养皿的底部；(3)活化聚丙烯酰胺凝胶表面，使细胞更好粘附生长。①取N-磺基琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯Sulfo-SANPAH水溶液均匀涂覆凝胶薄膜表面；②UV灯(强度＝37mW，λ＝302-365nm)处理5-10min，PBS冲洗过量的Sulfo-SANPAH；③I型胶原蛋白溶液浸泡凝胶，室温下静置2h或4℃下静置10-15h；④PBS冲洗过量的I型胶原蛋白溶液，UV(λ＝200nm)下灭菌，备用；(4)培养皿中加入细胞培养液浸没凝胶进行水合平衡，4℃下10-15h，随后立即用于细胞接种，或在4℃存放，48h以内使用最佳。所述Sulfo-SANPAH水溶液为0.35mg/ml。所述I型胶原蛋白溶液为0.2mg/ml。所述加入细胞培养液浸没凝胶后，在4℃下浸泡10-15h后立刻用于细胞接种，或4℃下存放，不超过48h使用效果最佳。所述N-磺基琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯(Sulfo-SANPAH，Mr492.40g/mol)的制备方法，包括以下步骤：将Sulfo-SANPAH以50mg/ml溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，按需等分，-80℃储备备用；所述过硫酸铵(Mr228.18g/mol)的制备方法，包括以下步骤：过硫酸铵溶于去离子水中，浓度为10％w/v，按需分装，-20℃储存备用；所述I型胶原蛋白溶液的制备方法，包括以下步骤：PBS中稀释稀释胶原蛋白原液为0.2mg/ml，暂存冰上或立即使用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了一种不同硬度的体外细胞培养基底材料聚丙烯酰胺凝胶薄膜的大批量制作方法，打破了聚丙烯酰胺凝胶薄膜只能实验室小规模制备、且制备过程冗长、繁琐的现状；本专利技术的制备方法，其操作简便、快捷有效、适合大批量制备所需的定制尺寸且经济成本低，制成的聚丙烯酰胺凝胶薄膜干燥后易于储存及运输，使用时达水合平衡后的聚丙烯酰胺凝胶也可满足细胞贴壁生长，降低了研究细胞力学的复杂性，有利于细胞力学性质的相关研究进行。附图说明图1为通过本专利技术的大批量制备方法制备出的不同硬度的体外细胞培养基底材料聚丙烯酰胺凝胶薄膜流程图；图2为本专利技术的大批量制备方法制备出的不同硬度的体外细胞培养基底材本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种不同硬度的体外细胞培养基底材料聚丙烯酰胺凝胶薄膜的大批量制作方法，其特征在于，包括以下步骤：/n（1）制备丙烯酰胺溶液、双丙烯酰胺溶液、过硫酸铵水溶液，备用；/n（2）制备疏水玻璃载玻片和疏水柔性塑料薄膜支撑物，备用；/n（3）丙烯酰胺溶液和双丙烯酰胺溶液脱气，加入过硫酸铵水溶液、N，N，N'，N'-四甲基乙二胺，混合，得凝胶溶液；/n（4）疏水玻璃载玻片作为底部，硅树脂隔离物在疏水玻璃载玻片外缘做四周支撑，滴加凝胶溶液；然后将柔性塑料薄膜支撑物亲水面平铺于凝胶溶液上，将疏水玻璃载玻片覆盖在柔性塑料薄膜支撑物上，干燥聚合。/n

【技术特征摘要】
1.一种不同硬度的体外细胞培养基底材料聚丙烯酰胺凝胶薄膜的大批量制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备丙烯酰胺溶液、双丙烯酰胺溶液、过硫酸铵水溶液，备用；
（2）制备疏水玻璃载玻片和疏水柔性塑料薄膜支撑物，备用；
（3）丙烯酰胺溶液和双丙烯酰胺溶液脱气，加入过硫酸铵水溶液、N，N，N'，N'-四甲基乙二胺，混合，得凝胶溶液；
（4）疏水玻璃载玻片作为底部，硅树脂隔离物在疏水玻璃载玻片外缘做四周支撑，滴加凝胶溶液；然后将柔性塑料薄膜支撑物亲水面平铺于凝胶溶液上，将疏水玻璃载玻片覆盖在柔性塑料薄膜支撑物上，干燥聚合。


2.根据权利要求1所述的不同硬度的体外细胞培养基底材料聚丙烯酰胺凝胶薄膜的大批量制作方法，其特征在于，所述丙烯酰胺溶液40%w/v；所述双丙烯酰胺溶液2%w/v；所述过硫酸铵水溶液10%w/v。


3.根据权利要求1所述的不同硬度的体外细胞培养基底材料聚丙烯酰胺凝胶薄膜的大批量制作方法，其特征在于，所述干燥聚合，可以为室温静置干燥聚合、对流干燥聚合或加热干燥聚合。


4.根据权利要求1所述的不同硬度的体外细胞培养基底材料聚丙烯酰胺凝胶薄膜的大批量制作方法，其特征在于，所述干燥聚合后，剥离剥离柔性塑料薄膜支撑物。


5.聚丙烯酰胺凝胶薄膜作为不同硬度的体外细胞培养基底材料的用途。


6.根据权利要求1所述的不同硬度的体外细胞培养基底材料聚丙烯酰胺凝胶薄膜的大批量制作方法，其特征在于，所述聚丙烯酰胺凝胶薄膜在不同硬度...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨卓，李玮珊，
申请(专利权)人：辽宁省肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：辽宁;21