本文提供了工程改造的无催化性无毒性破伤风毒素变体，以低剂量使用所述破伤风毒素变体的方法，和保护性疫苗，其无毒性且比其对应的化学灭活的类毒素而言效力更高。另外，本文提供了结合疫苗运载体，其包含工程改造的破伤风毒素变体，以及用这些结合疫苗引发T细胞依赖性免疫记忆应答的方法，其能作为单一疫苗靶向广谱的微生物病原体。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】作为疫苗的修饰的梭菌神经毒素和结合疫苗平台相关申请的交叉引用本申请要求2017年12月15日提交的美国临时申请第62/599,444号的优先权，其全部内容通过引用合并于此。关于联邦资助研究的声明本专利技术是用NIH-NIAID授予的资助号R01AI030162和AI118389的政府资助完成的。政府对本专利技术拥有一定的权利。
技术介绍
肉毒神经毒素(BoNT)是人类已知的最具毒性的物质，是肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)以及丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)和巴氏梭菌(Clostridiumbaratii)的选择菌株产生的蛋白质毒素(Hill和Smith，2013；Johnson和Montecucco，2008)。BoNT合成为150kDa双链蛋白，由通过二硫键连接的100kDa重链(HC)和50kDa轻链(LC)组成。HC进一步分为N末端结构域(HN)和C末端结构域(HC)，N末端结构域有助于将LC转运到细胞质中，C末端结构域识别并结合神经元细胞上的细胞表面受体(Montal，2010)。一旦进入细胞，LC就会特异性裂解一部分可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(SNARE)，从而使神经递质释放失活(Montecucco和Schiavo，1993，Trendsinbiochemicalsciences18,324-327；Schiavo等，1995)。先前使用实验疫苗保护“有风险”的人群抵抗肉毒，但由于其性能减弱，不再使用该化学灭活的BoNT类毒素疫苗。而且常规的破伤风毒素片段疫苗由于其抗原性和免疫效力差也不理想。因此，在本领域仍然需要无催化性无毒性的破伤风和肉毒毒素变体，以用作佐剂和结合疫苗。
技术实现思路
本文提供了破伤风毒素的重组无催化性无毒性变体形式，以及该变体毒素的用途。本文所述的数据显示相比天然破伤风毒素和先前所述的破伤风变体显著降低的毒性。我们设想了几种独立的工程改造突变，其灭活破伤风毒素的固有毒性，而且可组合产生安全有效的疫苗，包括但不限于通过除去底物亲和力或降低反应速率而消除催化活性，消除受体结合，抑制移位能力(potential)，或干扰毒素结构域间切割或二硫键打断，以及其他毒素中毒的其他步骤等。本文描述了实验，其中我们工程改造了具有宿主受体结合性减弱且催化性减弱的毒素。这些数据表明了包含了所选独立突变的重组毒素的能力，所述独立突变使其无毒并适用作疫苗或结合疫苗，而不需要化学交联以减少毒性。在第一个方面，本文提供了修饰的破伤风毒素多肽，其包含与SEQIDNO:1具有至少95％相同性且在位置R372和Y375的每一个都具有突变的序列，还包括在选自E334、K768、R1126和W1289的两个或更多个位置处的突变，其中每个位置根据SEQIDNO:1编号，所述多肽与SEQIDNO:1的毒性和受体结合相比具有减弱的催化活性，易位和受体结合。位置R372处的氨基酸R可被氨基酸A替代，位置Y375处的Y可被氨基酸F替代。突变可包括R372A,Y375F,E334Q,R1226L,和W1289A。修饰多肽还可包含共价连接的糖类，其中多肽是多肽-糖偶联物。修饰的多肽可由SEQIDNO:2编码。在一些情况下，突变可包含R372A,Y375F,E334Q,K768A,R1226L,和W1289A。修饰的多肽可由SEQIDNO:5编码。在一些情况下，修饰的多肽还可包含在位置L231和Y26中一或两者处突变，其中每个位置根据SEQIDNO:1编号。位置L231和Y26中一或两者处的突变包括L231K和Y26A。修饰的多肽可由SEQIDNO:6或SEQIDNO:7编码。在另一个方面，本文提供了包含本文所述的修饰多肽和药学上可接受的运载体的组合物。在一个方面，本文提供了减少患者产生破伤风的风险的方法，包括通过对患者施用治疗有效量的本文所述的修饰多肽以引发免疫应答。在一些情况下，修饰多肽用作佐剂。在一些情况下，修饰多肽用作疫苗。通过以下描述可以清楚地了解本专利技术的上述和其他方面和优势。在以下说明书中，参照构成说明书的一部分的附图，其中以说明性方式显示了本专利技术的优选实施方式。这类实施方式不必然代表本专利技术的全部范围，而是作为参考，由此对权利要求进行说明并在本文中解释本专利技术的范围。附图说明图1说明了用于评估宿主对接种的免疫应答的重组蛋白质。(上图)显示了用于该研究的BoNT衍生物的示意图。当说明时，用两个表位(His6和Strep)纯化蛋白。包括3XFLAG(3XF)和两个连续血凝素(2HA)表位用于细胞研究。用BoNT/A1(PDB:3BTA)的结晶结构确定结构域连接。每个示意图上的单氨基酸命名表示引入的氨基酸取代，用于减少催化(LC)或受体结合(HCC)。注意，用单链BoNT和LCHCN免疫。(下图)4μg指定蛋白质进行SDS-PAGE和考马斯蓝染色。泳道:1,M-BoNT/A1；2,M-BoNT/A1胰蛋白酶切割和还原的；3,M-LCHCN/A1；4.M-LCHCN/A1胰蛋白酶切割和还原的；5,LC/A1RY；6,HCC/A1W；和7,TeNTRY。分子量标记蛋白质(kDa)的迁移如左侧泳道所示。注意在泳道2中切割的HC跑胶于约80kDa处，这在其他实验中也有显示，归因于酪蛋白切割HC的带状区域。图2是用M-BoNT/A1或M-BoNT/A1W接种且用天然BoNT/A2(一种异源亚型)攻击的小鼠血清的ELISA。用M-BoNT/A1(上图)或M-BoNT/A1W(下图)接种小鼠，在106LD50天然BoNT/A2攻击前收集血清。表明在攻击中存活(A)或未存活(D)的小鼠。进行ELISA，测定M-BoNT/A1；M-LCHCN/A1；LC/A1RY；HCC/A1W；TeNTRY；和无蛋白对照(Con)的血清抗体滴度(1:20,000稀释度)。用山羊α-小鼠IgG-HRP(1:20,000稀释)，使用TMB试剂检测结合的小鼠抗体。用稀硫酸终止反应并在450nm处读数。数据表示成来自以双重复进行的两次独立实验的M-BoNT/A1接种后5只(A)小鼠和4只(D)小鼠的平均值，以及在M-BoNT/A1W接种后3只(A)和6只(D)小鼠的平均值，并标注了标准偏差。如本文所述进行统计分析：P,.05＝*.图3是用BoNT衍生物接种并用天然BoNT/A1攻击的小鼠的血清ELISA。用M-BoNT/A1W(0.3μg),M-LCHCN/A1(0.2μg),M-LCHCN/A1(0.2μg)+HCC/A1W(0.1μg),或HCC/A1W(0.3μg)接种小鼠。在BoNT攻击前获得血清。ELISA测定M-BoNT/A1；M-LCHCN/A1；LC/A1RY；HCC/A1W；TeNTRY；和无蛋白对照(Con)的血清抗体滴度(1:30,000稀释度)。用山羊α-小鼠IgG-HRP(1:20,000稀释)，使用TMB试剂检测结合的小鼠抗体。用稀硫酸终止反应并在450nm处读数。数据表示成来自表1实验3的在BoNT/A1攻击中存活下来的小鼠本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种修饰的破伤风毒素多肽，其包含与SEQ ID NO:1具有至少95％相同性且在位置R372和Y375的每一个都具有突变的序列，还包括在选自E334、K768、R1226和W1289的两个或更多个位置处的突变，其中每个位置根据SEQ ID NO:1编号，所述多肽与SEQ ID NO:1的毒性和受体结合相比具有减弱的毒性和受体结合。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171215 US 62/599,4441.一种修饰的破伤风毒素多肽，其包含与SEQIDNO:1具有至少95％相同性且在位置R372和Y375的每一个都具有突变的序列，还包括在选自E334、K768、R1226和W1289的两个或更多个位置处的突变，其中每个位置根据SEQIDNO:1编号，所述多肽与SEQIDNO:1的毒性和受体结合相比具有减弱的毒性和受体结合。
2.如权利要求1所述的修饰的多肽，其中R372位的氨基酸R被氨基酸A取代，其中Y375位的氨基酸Y被氨基酸F取代。
3.如权利要求1所述的修饰的多肽，其中突变包括R372A,Y375F,E334Q,R1226L,和W1289A。
4.如权利要求3所述的修饰的多肽，其中修饰的多肽由SEQIDNO:4编码。
5.如权利要求1所述的修饰的多肽，其中突变包括R372A,Y375F,E334Q,K768A,R1226L,和W1289A。
6.如权利要求5所述的修饰的多肽，其中修饰的多肽由SEQIDNO:5编码。
7.如权利要求1所述的修饰的多肽，还包含在位置L231和Y26中一或两者处的突变，其中每个位置根据SEQIDNO:1编号。
8.如权利要求7所述的修饰的多肽，其中位置L231和Y26中一或两者处的突变包括L231K和Y26A。
9.如权利要求7所述的修饰的多肽，其中修饰的多肽由SEQIDNO:6或SEQIDNO:7编码。
10.如权利要求1-9任一所述的修饰的多肽，还包含共价连接的糖类，其中多肽是多肽-糖偶联物。
【专利技术属性】
技术研发人员：J·T·巴比里，E·A·约翰逊，S·佩莱特，W·H·泰普，A·普莱兹佩斯基，
申请(专利权)人：威斯康星州医药大学股份有限公司，威斯康星校友研究基金会，
类型：发明
国别省市：美国;US
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