一种百草枯半抗原PH-A、人工抗原、抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种百草枯半抗原PH‑A、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。本发明专利技术首先提供了一种百草枯半抗原PH‑A，所述半抗原PH‑A的结构式如式(I)所示：

【技术实现步骤摘要】
一种百草枯半抗原PH-A、人工抗原、抗体及其制备方法和应用
本专利技术属于生物
更具体地，涉及一种百草枯半抗原PH-A、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
百草枯是一种联吡啶类的灭生性除草剂，因其具有活性佳、杀草谱广、防效好、见效快等特点广泛应用于农田间除草，药液接触土壤后能被土壤胶体迅速、强烈吸附，并完全钝化而不影响作物根部。但是，百草枯在土壤中有极强的吸附作用而在土壤中产生残留，并对水资源产生严重污染，且百草枯对人毒性极大；研究表明，百草枯的残留可能会导致肺纤维化，皮肤若长时间接触百草枯，或短时间接触高浓度百草枯，特别是破损的皮肤等均可导致全身中毒。这就要求对除草剂生产以及食品中百草枯残留量进行严格监测，以保护消费者的身心健康。目前，百草枯已被多个国家禁止或者严格限制使用，最新《农药管理条例》规定百草枯可溶胶剂从2020年9月26日起禁止使用，百草枯全面禁止使用；最新国标GB2763-2019限量要求更为苛刻，提升至0.005mg/kg。因此，需要一种快速、灵敏、高效的检测方法来实现对百草枯的快速检测。现有常见的检测百草枯的方法有：气相色谱-质谱法、液相色谱质谱联用法、紫外分光光度法、以及其他定量检测方法。高效液相色谱分析法、气相色谱等仪器分析方法其样本前处理及测定过程繁琐，费用高、需要专业人员操作，不适于大量样本筛查。而酶联免疫吸附检测法具有灵敏度高、特异性强、仪器设备要求低和样本前处理相对简单等优点，适于市场监测和现场监控。基于抗原-抗体特异性结合的免疫分析法主要以单克隆抗体和多克隆抗体为主，具有样本前处理简便、操作简单、快速、灵敏和高通量等特点，被誉为是21世纪最具有竞争和挑战的快速检测技术，在食品安全领域具有广阔的应用前景。但是，对于免疫分析法而言，抗体作为核心原材料，抗体的效果很大程度是取决于引起相应动物发生免疫反应的抗原结构。因此，提供一种抗原结构稳定，制备得到的抗体对百草枯的特异性强，能够快速、灵敏、准确的检测百草枯的方法具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有检测百草枯的方法的缺陷和不足，提供一种百草枯半抗原PH-A、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。本专利技术的目的是提供一种百草枯半抗原PH-A。本专利技术另一目的是提供一种百草枯人工抗原。本专利技术又一目的是提供所述人工抗原的制备方法。本专利技术再一目的是提供所述半抗原PH-A或所述人工抗原在制备特异性识别百草枯的纳米抗体Nb2-23中的应用。本专利技术再一目的是提供一种特异性识别百草枯的纳米抗体Nb2-23。本专利技术再一目的是提供一种编码所述纳米抗体Nb2-23的基因。本专利技术再一目的是提供一种重组载体。本专利技术再一目的是提供一种重组细胞。本专利技术再一目的是提供所述纳米抗体Nb2-23、所述基因、所述重组载体或所述重组细胞在检测百草枯中的应用。本专利技术再一目的是提供一种检测百草枯的方法。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术首先提供了一种百草枯半抗原PH-A，所述半抗原PH-A的结构式如式(I)所示：优选地，所述半抗原PH-A的制备方法为：将4'-(4-甲基苯基)-苯甲醛与具有式(III)所示结构式的羧甲基羟胺半盐酸盐进行肟化缩合衍生反应而得到。所述4'-(4-甲基苯基)-苯甲醛与羧甲基羟胺半盐酸盐进行肟化缩合衍生反应后，得到的半抗原PH-A与百草枯分子骨架结构重叠度高，有利于进行免疫诱导，有效地提高了半抗原PH-A的免疫原性。所述带羧基的羧甲基羟胺半盐酸盐的结构式如式(III)所示：本专利技术还提供了一种百草枯人工抗原，所述人工抗原的结构式如式(II)所示：本专利技术还提供了所述人工抗原的制备方法，采用活泼酯法将所述的半抗原PH-A与载体蛋白偶联制备得到；所述载体蛋白为卵清白蛋白或乳铁蛋白。所述半抗原PH-A与载体蛋白偶联时，半抗原PH-A的特异性结构突出于载体蛋白的表面，作为载体的一个抗原表位暴露给动物免疫系统，为得到特异性高、质量高的纳米抗体奠定了基础。另外，所述半抗原PH-A或所述人工抗原在制备特异性识别百草枯的纳米抗体Nb2-23中的应用，也应在本专利技术的保护范围之内。本专利技术还提供了一种特异性识别百草枯的纳米抗体Nb2-23，是由所述半抗原PH-A或所述人工抗原制备而得到；所述纳米抗体Nb2-23的VHH的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。优选地，所述纳米抗体Nb2-23的制备方法为：将所述人工抗原与等量弗氏佐剂混合乳化，免疫羊驼，在驼源免疫的纳米抗体库中筛选出能够与百草枯特异性结合的纳米抗体，通过基因工程重组表达的方式进行大量制备而得到。本专利技术还提供了一种编码所述纳米抗体Nb2-23的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供了一种重组载体，所述重组载体连接有所述基因。本专利技术还提供了一种重组细胞，所述重组细胞为携带有所述重组载体的细胞或能够表达所述纳米抗体Nb2-23的细胞。所述基因、所述重组载体或所述重组细胞在检测百草枯中的应用，也应在本专利技术的保护范围之内。另外，本专利技术还提供了一种检测百草枯的方法，用所述半抗原PH-A与卵清白蛋白偶联得到的完全抗原作为包被原，用所述纳米抗体Nb2-23作为检测抗体进行检测。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供了一种百草枯半抗原PH-A、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。本专利技术首先提供了一种百草枯半抗原PH-A，该半抗原PH-A与待测物百草枯的骨架结构重叠度高，有效地提高了半抗原PH-A的免疫原性；进一步利用该半抗原PH-A与乳铁蛋白偶联得到的人工抗原作为免疫原免疫羊驼，筛选得到了能够特异性识别百草枯的纳米抗体Nb2-23；该纳米抗体Nb2-23与百草枯其他结构及功能类似物均无交叉，利用其所建立的检测百草枯的方法的检测限为0.54ng/mL～3.86ng/mL，半抑制浓度为1.44ng/mL，最低检测限为0.34ng/mL，具有简便快速、特异性强、灵敏度高的特点；另外，该纳米抗体Nb2-23的制备方法简单，可用于环境和食品样品中百草枯的快速有效检测；因此，所述纳米抗体Nb2-23在检测百草枯中具有广阔的应用前景。附图说明图1是百草枯半抗原PH-A的质谱图。图2是纳米抗体Nb2-23的氨基酸编号及结构域示意图。图3是基于纳米抗体Nb2-23建立的间接竞争ELISA标准曲线图。具体实施方式以下结合具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。实施例1羊驼免疫抗体文库的构建(1)百草枯半抗原PH-A的制备由于百草枯是小分子不具有免疫原性，不能刺激羊驼产生免疫应答，进而产生抗体，故需要通过蛋白连接技本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种百草枯半抗原PH-A，其特征在于，所述半抗原PH-A的结构式如式(I)所示：

【技术特征摘要】
1.一种百草枯半抗原PH-A，其特征在于，所述半抗原PH-A的结构式如式(I)所示：


2.一种百草枯人工抗原，其特征在于，所述人工抗原的结构式如式(II)所示：


3.权利要求2所述人工抗原的制备方法，其特征在于，采用活泼酯法将权利要求1所述的半抗原PH-A与载体蛋白偶联制备得到；所述载体蛋白为卵清白蛋白或乳铁蛋白。


4.权利要求1所述半抗原PH-A或权利要求2所述人工抗原在制备特异性识别百草枯的纳米抗体Nb2-23中的应用。


5.一种特异性识别百草枯的纳米抗体Nb2-23，其特征在于，是由权利要求1所述半抗原PH-A或权利要求2所述人工抗原制备而得到；所述纳米抗体Nb2-23的VHH的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

【专利技术属性】
技术研发人员：沈玉栋，张咏仪，徐振林，王弘，杨金易，孙远明，肖治理，雷红涛，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44