一种抗氧化融合蛋白及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种抗氧化融合蛋白及应用，属于抗氧化技术领域，将金属硫蛋白和超氧化物歧化酶融合后得到抗氧化融合蛋白。本发明专利技术提供的抗氧化融合蛋白的抗氧化活性明显高于SOD蛋白，而且对温度、酒精、胃蛋白酶和胰蛋白酶具有耐受性，表明抗氧化融合蛋白可用作口服保健品和化妆品中。

【技术实现步骤摘要】
一种抗氧化融合蛋白及应用
本专利技术涉及抗氧化
，具体涉及一种抗氧化融合蛋白及应用。
技术介绍
超氧化物歧化酶SOD，是英文SuperoxideDismutase的缩写，是体内对抗自由基的第一道防线。根据其活性中心结合的金属离子的不同，SOD主要分为三类：铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD，也称为SOD1)、铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD)和锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)。其中，Fe-SOD主要存在于原核细胞的基质中。当我们身体吸入氧气进行新陈代谢，就会产生超氧阴离子自由基，若不予以消除，会在体内产生连锁反应破坏细胞。正常情况下，体内自由基的产生和清除处于动态平衡。SOD在年轻人的血液中很多，人们过了30岁以后，人体内的SOD随着人体组织的老化而产生率逐渐降低。由于体内的SOD随着年龄的增加而渐减，再加上环境的恶化，大量的自由基超过身体所能应付的程度，因此借助外来的补充是必需的。SOD的来源极为广泛，目前已从细菌、真菌、藻类、鱼类、昆虫、植物和哺乳类动物等各种生物体分离得到。国内已开发的SOD资源有：动物血液(牛、猪等)，菌类发酵(酵母菌、大肠杆菌等)，高等植物(藻类、刺梨等)等。动物提取SOD的主要原料可以是各种哺乳动物血液、肝脏、脑等，然而一些人畜共患病的原因使得许多国家禁止在食品、化妆品、医疗等领域使用动物来源的SOD。然而从上述来源中所提取的SOD普遍存在酶活性较低、清除氧自由基的能力较差等缺点。金属硫蛋白(Metallothionein，MT)，又称巯基金属结合蛋白，化学名为金属硫组氨酸三甲基内盐，是一种广泛存在于人体、动物、植物以及微生物体内的有特殊功能的蛋白质。人类MT按分子特征和分布分为四个亚群：MT1、MT2、MT3、MT4。MT1又分9个亚类，MT2又分MT-2a和MT-2b。MT1和MT2分布全身，MT3分布于脑，MT4主要分布于皮肤。具有参与体内微量元素代谢、重金属解毒、清除自由基、参与DNA复制和转录，影响蛋白质和能量代谢、拮抗电离辐射、增强机体免疫力和应激保护等生物学功能。其中，清除自由基和结合金属离子是MT最重要的两项功能。当前国内对MT的研究开发虽然起步较早，但大多都集中在基因的克隆和生物学功能的探讨上，并没有大规模生产应用重组金属硫蛋白融合蛋白。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种抗氧化融合蛋白，采用本专利技术提供的抗氧化融合蛋白，与超氧化物歧化酶相比，提高了酶活，进而提高了抗氧化活性。本专利技术提供了一种抗氧化融合蛋白，将金属硫蛋白和超氧化物歧化酶融合后得到。优选的，所述融合包括直接融合或通过连接肽融合。优选的，所述抗氧化融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。所述抗氧化融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.12所示。优选的，所述抗氧化融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.17所示。优选的，所述抗氧化融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.22所示。优选的，所述抗氧化融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：1)以MT-2a全基因组序列为模版，用MT-Fw-2和MT-Rev-2引物对进行第一PCR扩增，得到MT-2a片段；所述MT-Fw-2引物具有SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；所述MT-Rev-2引物有SEQIDNo.3所示的核苷酸序列；2)以FeSOD全基因组序列为模版，用SOD-Fw-2和SOD-Rev-2引物对进行第二PCR扩增，得到FeSOD片段；所述SOD-Fw-2引物具有SEQIDNo.4所示的核苷酸序列；所述SOD-Rev-2引物具有SEQIDNo.5所示的核苷酸序列；3)将所述步骤1)得到的MT-2a片段与步骤2)得到的FeSOD片段混合后进行第三PCR扩增，得到扩增产物；4)以所述步骤3)得到的扩增产物为模版，用MT-Fw-2和SOD-Rev-2引物对进行第四PCR扩增，得到MT-SOD-his片段；5)将所述步骤4)得到的MT-SOD-his片段连接到载体上，转化大肠杆菌后，得到抗氧化融合蛋白。优选的，所述步骤1)第一PCR扩增的程序包括：95℃，2min；95℃，30s，57℃，30s，72℃，10s，30个循环；72℃，5min。本专利技术还提供了上述技术方案所述的抗氧化融合蛋白在制备化妆品中的应用。本专利技术还提供了上述技术方案所述的抗氧化融合蛋白在制备增强机体免疫力保健品中的应用。本专利技术提供了一种抗氧化融合蛋白，将金属硫蛋白和超氧化物歧化酶融合后得到。本专利技术将金属硫蛋白和超氧化物歧化酶融合后，提高了融合蛋白的酶活，进而提高了抗氧化能力。本专利技术实施例的结果显示：本专利技术提供的抗氧化融合蛋白的抗氧化活性均明显高于Fe-SOD蛋白，而且对温度、酒精、胃蛋白酶和胰蛋白酶具有耐受性，表明抗氧化融合蛋白可用作口服保健品和化妆品中。附图说明图1为不同pH值处理MT-SOD融合蛋白和SOD的结果；图2为不同温度处理MT-SOD融合蛋白和SOD结果，以横坐标40min时为基准，最上边的线为70℃处理MT-SOD融合蛋白结果，从上往下的第二条线为70℃处理SOD结果，从上往下第三条线为90℃处理MT-SOD融合蛋白结果，最下边的一条线为90℃处理SOD结果；图3为蛋白对酒精耐受结果，其中，以横坐标10％时为基准，最上边的线为MT-SOD融合蛋白的酒精耐受结果，最下边的线为SOD的酒精耐受结果；图4为胃蛋白酶处理MT-SOD融合蛋白和SOD结果，以横坐标3min时为基准，最上边线为胃蛋白酶处理MT-SOD融合蛋白的结果，最下边线为胃蛋白酶处理SOD的结果；图5为胰蛋白酶处理MT-SOD融合蛋白和SOD结果，最上边线为胰蛋白酶处理MT-SOD融合蛋白结果，最下边线为胰蛋白酶处理SOD结果。具体实施方式本专利技术提供了一种抗氧化融合蛋白，其特征在于，将金属硫蛋白和超氧化物歧化酶融合后得到。本专利技术对所述金属硫蛋白没有特殊限定，优选采用人金属硫蛋白，更优选采用人金属硫蛋白的不同亚型，或不同种属来源的其它金属硫蛋白及其变异体。在本专利技术中，所述金属硫蛋白融合在所述超氧化物歧化酶的N端或C端。在本专利技术中，所述超氧化物歧化酶包括来源于藻类、细菌、真菌、动物肝的Fe-SOD及其变异体、Mn-SOD及其变异体、Cu/Zn-SOD及其变异体。其中所述变异体不仅指全长蛋白，还包括天然产生或非天然产生的变异体。例如由常规基因工程方法产生的氨基酸突变体，个别氨基酸化学修饰突变体等，与本专利技术所公开的金属硫蛋白和超氧化物歧化酶天然产生的蛋白质序列至少有60％相似或50％相同，更优选的至少75％相似或55％相同，最优选的80％相似或60％相同。在本专利技术中，所述融合优选包括直接融合或通过连接肽融合。本专利技术对所述连接肽没有特殊限定，采用常规即可，如(GGGGs)n、(EAAK)n或富含脯氨酸的序列。本专利技术对所述通过连接肽融合的方法没有特殊限定本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗氧化融合蛋白，其特征在于，将金属硫蛋白和超氧化物歧化酶融合后得到。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗氧化融合蛋白，其特征在于，将金属硫蛋白和超氧化物歧化酶融合后得到。


2.根据权利要求1所述的抗氧化融合蛋白，其特征在于，所述融合包括直接融合或通过连接肽融合。


3.根据权利要求1或2所述的抗氧化融合蛋白，其特征在于，所述抗氧化融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。


4.根据权利要求1或2所述的抗氧化融合蛋白，其特征在于，所述抗氧化融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.12所示。


5.根据权利要求1或2所述的抗氧化融合蛋白，其特征在于，所述抗氧化融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.17所示。


6.根据权利要求1或2所述的抗氧化融合蛋白，其特征在于，所述抗氧化融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.22所示。


7.根据权利要求3所述的抗氧化融合蛋白，其特征在于，所述抗氧化融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
1)以MT-2a全基因组序列为模版，用MT-Fw-2和MT-Rev-2引物对进行第一PCR扩增，得到MT-2a片段；
所述MT-Fw-2引物具有SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；
所述MT-Rev-2...

【专利技术属性】
技术研发人员：王学庆，李鹏云，王楠，
申请(专利权)人：江苏芝大生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32