二甲双胍靶向COX6B2在制备治疗胰腺癌药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种二甲双胍靶向COX6B2在制备治疗胰腺癌(PDAC)药物中的应用，二甲双胍通过线粒体COX6B2降低线粒体氧化磷酸化水平，导致PDAC能量代谢减弱，进而抑制PDCA细胞的侵袭和迁移。本发明专利技术通过构建不同的PDAC细胞模型，采用二甲双胍处理其PDAC细胞株，发现二甲双胍、COX6B2及氧化磷酸化与PDAC之间的作用机制，这一发现不仅能为PDAC的诊断提供有效的分子标记物，还将为PDAC治疗的药物靶点设计和药物选择提供理论指导，具有重要的临床意义和社会价值。

【技术实现步骤摘要】
二甲双胍靶向COX6B2在制备治疗胰腺癌药物中的应用
本专利技术涉及临床医学领域，特别是涉及一种二甲双胍靶向COX6B2在制备治疗胰腺癌药物中的应用。
技术介绍
胰腺癌是一种高度恶性的肿瘤，诊断晚期和预后极差导致胰腺癌的死亡率很高。由于肿瘤细胞转移，即使是接受过根治性切除术的患者也有很高的疾病复发风险。癌症睾丸抗原是睾丸特异性蛋白，只存在于睾丸组织中，但发现在多种肿瘤中高表达。线粒体是细胞的能量供应中心，对细胞的生长、分裂、迁移、侵袭、能量代谢和细胞凋亡至关重要。线粒体氧化磷酸化功能障碍会导致机体多个组织、器官、系统出现功能障碍，从而引起一些复杂的疾病，比如癌症，这些疾病的致死率和致残率都非常高。肿瘤生长需要大量的能量，而线粒体作为细胞能量代谢中心，其功能的改变必然会参与肿瘤细胞能量代谢的重编程过程中。OXPHOS对于肿瘤进程起着重要作用，该观点认为线粒体功能改变的逆向信号分子(如ROS，ATP等)能逆向调控核基因表达下的信号转导通路蛋白，从而促进肿瘤的发生。另一方面，OXPHOS是一种在线粒体中合成ATP的高效方法，在肿瘤转移期间，能量活跃的线粒体需要从通常发现它们的核周区域重新定位到细胞的前缘。这种重新定位有利于提供癌细胞侵入周围组织所需的局部能量，从而促进肿瘤细胞的侵袭性和迁移性。总而言之，OXPHOS影响肿瘤的增殖与转移。细胞色素c氧化酶蛋白(COX)作为呼吸链中的最终电子供体起作用，驱动电子穿过线粒体内膜形成质子梯度，最终导致ATP和水的产生，在线粒体OXPHOS中起关键作用。同时，细胞色素c氧化酶亚基6B2(COX6B2)是COX复合体蛋白中的一个亚基，在睾丸中特异性表达，通常不在其他正常组织中表达，并且发现在多种肿瘤中高表达，可能参与肿瘤增殖和转移的过程，而值得注意的是，现有技术中二甲双胍除了是2型糖尿病(T2DM)患者的一线口服药物以外，还没有对于癌症相关作用机制的研究，尤其是二甲双胍如何影响PDAC发生及发展的作用机制至今尚无相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种二甲双胍靶向COX6B2在制备治疗胰腺癌药物中的应用，通过构建不同的PDAC细胞模型，采用二甲双胍处理其PDAC细胞株，发现二甲双胍可通过线粒体COX6B2降低线粒体氧化磷酸化水平，导致PDAC能量代谢减弱，进而抑制PDCA细胞的侵袭和迁移，这不仅能为PDAC的诊断提供有效的分子标记物，还将为PDAC治疗的药物靶点设计和药物选择提供理论指导，具有重要的临床意义和社会价值。为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：本专利技术提供一种二甲双胍靶向COX6B2在制备治疗胰腺癌药物中的应用，其特征在于，二甲双胍通过线粒体COX6B2降低线粒体氧化磷酸化水平，导致PDAC能量代谢减弱，进而抑制PDCA细胞的侵袭和迁移。优选的是，通过构建不同的PDAC细胞模型，在二甲双胍作用下检测线粒体COX6B2降低线粒体氧化磷酸化水平。优选的是，所述PDAC细胞模型的构建方法，具体包括以下步骤：步骤1：利用COX6B2shRNA序列，如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示，合成目的DNA；步骤2：将目的DNA插入包装质粒pLKO.1-puro后，共转染到HEK293T细胞中，构建慢病毒质粒；步骤3：将所得慢病毒质粒分别转染不同的胰腺癌细胞，经培养，筛选稳定表达的COX6B2细胞，以获取COX6B2蛋白敲低的不同PDAC细胞模型。优选的是，步骤3中所述胰腺癌细胞为SW1900、Patu-8988或Panc-1细胞。优选的是，步骤3中用含有嘌呤霉素或潮霉素的LB培养基进行培养。优选的是，所述线粒体氧化磷酸化水平的评价指标包括细胞氧化呼吸能力、细胞OCR/ECAR水平、线粒体膜电位水平、ATP生成能力以及ROS水平。优选的是，所述能量代谢的评价指标包括PDAC细胞中的ATP和ADP能量水平。本专利技术公开了以下技术效果：本专利技术通过选取其中三株胰腺癌细胞系SW1990，Patu-8988，Panc-1，成功构建COX6B2蛋白敲低细胞模型，结果发现当COX6B2蛋白敲低后，癌细胞在体外的迁移和侵袭能力均显著下降，而细胞生长不受影响，说明COX6B2对促进胰腺癌转移具有直接关系。进一步的，通过氧耗能力检测技术、ATP及ROS生成实验、MMP检测技术对COX6B2敲低蛋白胰腺癌模型细胞OXPHOS水平进行检测，发现COX6B2蛋白低表达后，癌细胞氧呼吸能力下降，细胞内整体ATP水平和线粒体内ATP生成能力都下降，线粒体膜电位下降，线粒体内ROS生成增高，但是细胞内ROS生成没有显著差异，说明COX6B2蛋白对于维持线粒体OXPHOS功能起着重要作用。通过给予Rotenone和叠氮化钠处理胰腺癌细胞(SW1990，Patu-8988，Panc-1)，发现癌细胞的迁移和侵袭能力降低，说明抑制线粒体OXPHOS功能对于癌细胞的迁移和侵袭起抑制作用。通过给予ATP处理COX6B2蛋白低表细胞，发现COX6B2KD细胞的迁移和侵袭能力提高，说明ATP有利于胰腺癌细胞的迁移和侵袭。通过对EMT相关蛋白进行检测，结果表明SW1990，Patu-8988，Panc-1细胞中COX6B2蛋白敲低后，E-Cadherin蛋白表达水平增高，N-Cadherin/Vimentin/SNAIL蛋白表达水平降低，表明COX6B2能影响EMT相关蛋白的表达。而专利技术人通过二甲双胍处理PDAC细胞后，同样发现在所有编码OXPHOS基因中，COX6B2表达的变化位居首位，此外，通过Panc-1细胞中用α-amanitin抑制RNA转录，发现含有二甲双胍的细胞中，COX6B2mRNA的降解比对照细胞降解的快，说明二甲双胍通过促进COX6B2mRNA的降解抑制COX6B2的表达，并且呈现以时间依赖性方式表现出降低COX6B2水平；而通过BN-PAGE分析不同PDAC细胞模型结果显示：二甲双胍处理的PDAC细胞壁未处理的细胞表现出更低的OXPHOS复合物水平；此外，还发现二甲双胍处理的Patu-8988细胞3天足以导致COX6B2水平显著降低，可显著抑制PDAC细胞的迁移能力，而细胞的复制仍未受到影响。总而言之，本专利技术验证了二甲双胍可以通过抑制COX6B2的表达来模拟COX6B2敲低对PDAC细胞侵袭和迁移的影响，因此，二甲双胍可能在靶向高COX6B2胰腺癌的治疗方法中成为最具有潜力的药物，这一发现不仅能为PDAC的诊断提供有效的分子标记物，还将为PDAC治疗的药物靶点设计和药物选择提供理论指导，具有重要的临床意义和社会价值。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为经/未经二甲双胍预处理PANC-1细胞的氧化磷酸化相关基因表达水平；其中，A为PDAC与对照组织本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种二甲双胍靶向COX6B2在制备治疗胰腺癌药物中的应用，其特征在于，二甲双胍通过线粒体COX6B2降低线粒体氧化磷酸化水平，导致PDAC能量代谢减弱，进而抑制PDCA细胞的侵袭和迁移。/n

【技术特征摘要】
1.一种二甲双胍靶向COX6B2在制备治疗胰腺癌药物中的应用，其特征在于，二甲双胍通过线粒体COX6B2降低线粒体氧化磷酸化水平，导致PDAC能量代谢减弱，进而抑制PDCA细胞的侵袭和迁移。


2.如权利要求1所述的二甲双胍靶向COX6B2在制备治疗胰腺癌药物中的应用，其特征在于，通过构建不同的PDAC细胞模型，在二甲双胍作用下检测线粒体COX6B2降低线粒体氧化磷酸化水平。


3.如权利要求2所述的二甲双胍靶向COX6B2在制备治疗胰腺癌药物中的应用，其特征在于，所述PDAC细胞模型的构建方法，具体包括以下步骤：
步骤1：利用COX6B2shRNA序列，如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示，合成目的DNA；
步骤2：将目的DNA插入包装质粒pLKO.1-puro后，共转染到HEK293T细胞中，构建慢病毒质粒；
步骤3：将所得慢病毒质粒分别转染不同的胰腺癌细胞，经培养，筛...

【专利技术属性】
技术研发人员：方合志，沈丽君，吴旭聪，聂珂，李晋，王雨晴，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33