嘌呤的发酵生产工艺制造技术

本发明专利技术涉及一种嘌呤的发酵生产工艺，包括以下步骤：(1)将海洋芽孢杆菌Bacillus sp.JIN118进行活化，得到单一菌落；(2)种子液扩大培养，得到种子液；(3)将种子液接种到发酵培养基中发酵，得到发酵液；(4)对发酵液离心、萃取，进行初级分离，获得嘌呤纯品；(5)单因素试验初步优化嘌呤的发酵生产工艺；(6)正交实验确定最优的发酵生产工艺条件。本发明专利技术涉及到的发酵工艺大幅提高了嘌呤的产量，经优化后嘌呤的产量由基础发酵培养基中的4.76mg/L提高到17.88mg/L，具有发酵产率高、周期短、条件易控制等优点，解决了化学合成法合成嘌呤耗费大量有机溶剂，原料来源困难及环境污染等问题。

【技术实现步骤摘要】
嘌呤的发酵生产工艺
本专利技术属于微生物发酵
，具体涉及一种嘌呤的发酵生产工艺。
技术介绍
嘌呤是一种有机合成中间体，是非常重要的化工原料，广泛用于染料、农药、医药及香料等产品的生产，社会需求量很大。另外，许多嘌呤类似物在临床上用作抗肿瘤药物，如天然的咖啡碱对人体有兴奋、利尿的作用。因此，嘌呤化合物在生命健康中具有非常重要的作用。目前生产嘌呤的方法主要有化学合成法。由于化学合成法需要大量有机溶剂，存在原料来源及环境污染等问题。发酵法生产嘌呤还未见报道，但一般来说，发酵法生产化工原料具有周期短、控制容易等优点，具有广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种提高嘌呤产量、提高生产效率的发酵嘌呤的优化工艺。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案得以实现的一种嘌呤的发酵生产工艺，具体包括以下步骤：(1)将海洋芽孢杆菌Bacillussp.JIN118进行活化，得到单一菌落；(2)挑取活化好的单一菌落，进行种子液扩大培养，得到种子液；(3)将种子液接种到发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；(4)对发酵液进行离心处理，弃菌体，得到上清；上清液加入等体积的乙酸乙酯萃取，萃取液通过中压制备色谱法进行初级分离，得到粗品；将粗品利用制备型高效液相色谱分离获得嘌呤纯品。上述嘌呤化合物其具体结构如式Ⅰ所示：本专利技术有益效果如下：本专利技术嘌呤的发酵生产工艺优化后，具有发酵周期短、发酵成本低廉、发酵条件简单容易控制等特点。本专利技术的有益效果在于解决了化学合成法获得嘌呤的过程中耗费大量有机溶剂，原料来源困难及环境污染等问题。发酵法生产嘌呤由于其产率高、周期短、控制容易等优点。本专利技术提供了一种嘌呤的发酵生产工艺，本专利技术旨在通过优化嘌呤的发酵生产工艺进一步提高嘌呤产量，目的在于解决化学合成法合成嘌呤化合物过程副产物多、难分纯、反应条件不可控等技术问题。本专利技术提供了一种嘌呤的发酵生产工艺，通过单因素实验初步确定嘌呤的最佳发酵生产工艺条件，再结合正交试验进一步确定最优的发酵生产工艺条件为：(NH4)2SO4作为氮源且添加量为11g/L，温度为37℃，转速为150r/min，培养时间为72h，pH为7.0。经优化后嘌呤的产量由基础发酵培养基中的4.76mg/L提高到17.88mg/L，本专利技术具有发酵产率高、周期短、条件容易控制等优点，解决了化学合成法合成嘌呤耗费大量有机溶剂，原料来源困难及环境污染等问题，将成为工业化生产嘌呤的重要方法。且本专利技术中海洋芽孢杆菌Bacillussp.JIN118稳定生产嘌呤，便于后期嘌呤的工业生产开发。附图说明图1含嘌呤组分的高效液相色谱检测结果；图2为本专利技术嘌呤纯度检测结果；图3为本专利技术嘌呤标准品的标准曲线；图4为本专利技术氮源的筛选结果；图5为本专利技术(NH4)2SO4浓度的优化结果；图6为本专利技术发酵温度优化结果；图7为本专利技术发酵时间优化结果；图8为本专利技术摇床培养转速优化结果；图9为本专利技术初始pH优化结果；图10为本专利技术菌株JIN118的系统发育树。具体实施方式下面通过具体实施例详述本专利技术，但不限制本专利技术的保护范围。如无特殊说明，本专利技术所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。本专利技术的海洋芽孢杆菌Bacillussp.JIN118已提交保藏，具体保藏信息如下：保藏编号：CCTCCNO：M2019988；保藏日期：2019年12月2日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国武汉武汉大学。16SrDNA序列分析使用无菌接种环挑取单菌落于装有10μL无菌超纯水的PCR管中，混匀，100℃煮沸5min，4℃冷却5min，吸取4μL上清液作为PCR扩增的DNA模板，按照表1中50μL体系加入所需试剂，表2条件进行PCR扩增。PCR扩增产物进行核酸电泳和测序，将菌株JIN118的16SrDNA的序列(1460bp)在NCBI核酸数据库中通过BLAST进行分析并绘制系统发育树，结果如图10所示。经分析可以确定该菌株为芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌，命名为Bacillussp.JIN118。表1PCR反应体系(50μL)表2PCR反应条件实施例1菌种活化及发酵(1)菌种活化将保存在-80℃冰箱中的海洋芽孢杆菌Bacillussp.JIN118涂布于基础发酵固体培养基上，30℃培养16-24h。基础发酵培养基(g/L)包含：蛋白胨5g，酵母粉10g，葡萄糖10g，磷酸二氢钾(KH2PO4)1g，琼脂20g，陈海水1L。(2)种子培养使用灭好菌的牙签挑取单菌落，接种到装有2mL基础发酵培养基的试管中，30℃、180r/min摇床振荡培养16-24h。然后以1％的接种量接种至装液量为40％的基础发酵培养基中(基础发酵培养基配方如步骤(1)中配方一致)，30℃、180r/min摇床振荡培养24h得到种子液。(3)发酵培养将种子液按5％的接种量接种，30℃、180r/min振荡培养72h。(4)发酵液前处理发酵液于8000r/min离心10min，即得到发酵上清液。上清液加入等体积乙酸乙酯充分萃取三次，合并有机相，旋转蒸发浓缩，得到乙酸乙酯膏状粗提物。进一步的，所述步骤(4)具体为：膏状粗提物通过中压制备色谱法进行粗分离，色谱柱填料为硅胶粉，流动相为石油醚/乙酸乙酯和二氯甲烷/甲醇，经高效液相色谱法检测合并含嘌呤组分。进一步的，所述步骤(4)具体为：利用高效液相色谱仪对中压制备后获得的含嘌呤组分进行嘌呤含量的检测，检测结果如图1所示。其纯度达到了94％，纯度检测结果如图2所示。(5)嘌呤标准曲线标准曲线的制作，准确称取嘌呤标准品3mg，用甲醇溶解并定容至120μg/mL，用甲醇逐级稀释至不同的浓度60μg/mL、30μg/mL、15μg/mL、7.5μg/mL，利用高效液相色谱仪分别对5个梯度浓度标准溶液的峰面积进行测定，各进样20μL，平行测定3次，取平均峰面积，嘌呤标准品的溶液浓度及峰面积如表3所示。以标准品溶液浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标作图，测得嘌呤标准品的线性方程为y＝145746.80+88082.67x，相关系数R2＝0.99954，结果如图3所示。含量检测：本实验采用外标法分别对标准品和待测物质进行高效液相色谱检测，可根据其相同保留时间对应的峰值的峰面积比例来测定待测物的含量。测定条件为色谱柱InnovalODS-2C18(4.6x250mm，5μm)，检测波长222nm，流动相为10％-90％甲醇水，流速为0.8mL/min，进样量20μL。表3嘌呤标准品的溶液浓度及峰面积实施例2单因素实验通过单因素实验初步确定氮源及最佳的发酵条件，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种嘌呤的发酵生产工艺，其特征在于，包括具体步骤如下：/nS1菌种活化：将保存在-80℃冰箱中的海洋芽孢杆菌Bacillus sp.JIN118涂布于基础发酵固体培养基上，于30℃培养16-24h；/nS2种子培养：使用灭好菌的牙签挑取单菌落，接种到装有2mL基础发酵培养基的试管中，30℃、180r/min摇床振荡培养16-24h，然后以1％的接种量接种至装液量为40％的基础发酵培养基中，30℃、180r/min摇床振荡培养24h，得到种子液；/nS3发酵培养：将种子液按5％的接种量接种于含一定量氮源的基础发酵培养基中，于22-42℃、100-250r/min摇床振荡培养24-144h；发酵pH值5-10；/nS4发酵液前处理：发酵液于8000r/min离心10min，即得到发酵上清液，上清液加入等体积乙酸乙酯充分萃取三次，合并有机相，旋转蒸发浓缩，得到乙酸乙酯膏状粗提物，膏状粗提物通过中压制备色谱法进行粗分离，色谱柱填料为硅胶粉，流动相为石油醚/乙酸乙酯和二氯甲烷/甲醇，用高效液相色谱检测嘌呤的含量；/nS5.嘌呤标准曲线制作：以标准品溶液浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标作图，采用外标法分别对标准品和待测物质进行高效液相色谱检测，根据其相同保留时间对应的峰值的峰面积比例来测定待测物的含量；/nS6.单因素试验初步优化嘌呤的发酵生产工艺；/nS7.在单因素试验结果的基础上，结合正交实验进一步确定最优的发酵生产工艺条件。/n...

【技术特征摘要】
20190930 CN 20191093962951.一种嘌呤的发酵生产工艺，其特征在于，包括具体步骤如下：
S1菌种活化：将保存在-80℃冰箱中的海洋芽孢杆菌Bacillussp.JIN118涂布于基础发酵固体培养基上，于30℃培养16-24h；
S2种子培养：使用灭好菌的牙签挑取单菌落，接种到装有2mL基础发酵培养基的试管中，30℃、180r/min摇床振荡培养16-24h，然后以1％的接种量接种至装液量为40％的基础发酵培养基中，30℃、180r/min摇床振荡培养24h，得到种子液；
S3发酵培养：将种子液按5％的接种量接种于含一定量氮源的基础发酵培养基中，于22-42℃、100-250r/min摇床振荡培养24-144h；发酵pH值5-10；
S4发酵液前处理：发酵液于8000r/min离心10min，即得到发酵上清液，上清液加入等体积乙酸乙酯充分萃取三次，合并有机相，旋转蒸发浓缩，得到乙酸乙酯膏状粗提物，膏状粗提物通过中压制备色谱法进行粗分离，色谱柱填料为硅胶粉，流动相为石油醚/乙酸乙酯和二氯甲烷/甲醇，用高效液相色谱检测嘌呤的含量；
S5.嘌呤标准曲线制作：以标准品溶液浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标作图，采用外标法分别对标准品和待测物质进行高效液相色谱检测，根据其相同保留时间对应的峰值的峰面积比例来测定待测物的含量；
S6.单因素试验初步优化嘌呤的...

【专利技术属性】
技术研发人员：权春善，刘宝全，金梅姝，郭斌梅，陈苛蒙，金黎明，俞勇，郑立，
申请(专利权)人：大连民族大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21