一种海洋芽孢杆菌Bacillus sp.JIN118发酵生产嘌呤的制备方法技术

本发明专利技术属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种海洋芽孢杆菌Bacillus sp.JIN118发酵生产嘌呤及其制备方法。该制备方法包括以下步骤：(1)将海洋芽孢杆菌Bacillus sp.JIN118进行活化并发酵，得到发酵液；(2)对发酵液进行离心处理，弃菌体，得到上清；(3)上清液加入等体积的乙酸乙酯萃取，萃取液通过中压制备色谱法进行初级分离，得到粗品；(4)将粗品利用制备型高效液相色谱分离获得嘌呤纯品。本发明专利技术涉及到的海洋芽孢杆菌Bacillus sp.JIN118能够稳定生产嘌呤，且制备方法快速、有效，可为制备具有较强抑菌作用及抗肿瘤活性的嘌呤衍生物提供原材料，具有广泛的工业应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种海洋芽孢杆菌Bacillussp.JIN118发酵生产嘌呤的制备方法
本专利技术属于微生物发酵
，具体涉及一种海洋芽孢杆菌Bacillussp.JIN118发酵生产嘌呤的制备方法。
技术介绍
嘌呤(Purine，C5H4N4)在生物体内主要以嘌呤核苷酸的形式存在，在能量供应、代谢调节及辅酶合成等方面起着十分重要的作用。由于N原子上所连的H原子的位置不同，嘌呤有四种可能的互变异构体，其中异构体3和4存在的机率很小，在结晶状态下，主要以2式存在，在溶液中则主要以1和2接近于等分子比的形式存在。嘌呤是一种有机合成中间体，是非常重要的化工原料，广泛用于染料、农药、医药及香料等产品，社会需求量很大。嘌呤衍生物多数具有较好的生物活性。同时，嘌呤及其衍生物属于高能密度化合物，可用于制备高能量密度材料，在军事、烟火等方面具有广泛的应用价值。现有技术中，对嘌呤核苷酸和嘌呤类化合物的制备以及应用研究较多，但对嘌呤本体的生物合成方面的研究报道较少。目前，嘌呤主要通过化学合成的手段得到，尚无从植物或微生物发酵产物中分离获得的报道。本专利技术提供了一株能够稳定生产嘌呤的菌株以及一种工艺简单，安全可靠，成本低，污染少的嘌呤的制备方法。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术提供了一种海洋芽孢杆菌Bacillussp.JIN118发酵生产嘌呤的制备方法。本专利技术的专利技术构思是：现有技术中，从天然产物中分离制备嘌呤的研究报道较少，目前市售的嘌呤主要通过化学合成的方法得到。尤其是，微生物代谢产物中制备嘌呤的报道尚无发现。本专利技术人从北冰洋的海泥样品中分离筛选出一株海洋芽孢杆菌Bacillussp.JIN118，该芽孢杆菌经液体发酵，在其代谢产物中检测并分离得到纯度较高的嘌呤。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种海洋芽孢杆菌Bacillussp.JIN118发酵生产嘌呤的制备方法具体为：(1)将海洋芽孢杆菌Bacillussp.JIN118进行活化并发酵，得到发酵液；(2)对发酵液进行离心处理，弃菌体，得到上清；(3)上清液加入等体积的乙酸乙酯萃取，萃取液通过中压制备色谱法进行初级分离，得到粗品；(4)将粗品利用制备型高效液相色谱分离获得嘌呤纯品。进一步的，所述步骤(1)中，海洋芽孢杆菌Bacillussp.JIN118活化和发酵过程是：从-80℃取出冻干保存管，接种到试管斜面，培养温度30℃，时间为16-24h，再从试管斜面挑去少量菌体接种至装有种子培养液的三角瓶中，于30℃，180r/min摇床振荡培养24h，然后按照5％的接种量接种至装有发酵培养基的三角瓶中，30℃，180r/min培养72h。更进一步的，所述步骤(1)具体包括以下步骤：(1.1)菌种活化将保存在-80℃冰箱中的海洋芽孢杆菌Bacillussp.JIN118涂布于固体培养基上，30℃培养24h。固体培养基配方包含：去离子水1L，蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，琼脂15g。(1.2)种子液培养使用灭好菌的牙签挑取单菌落，接种到装有2mL培养基的试管中，30℃、180r/min摇床振荡培养24h。然后以1％的接种量接种至装液量为40％的发酵培养基中，30℃、180r/min摇床振荡培养24h。发酵培养基配方包含：海水1L，马铃薯葡萄糖肉汤培养基35g。(1.3)发酵培养将种子液按5％的接种量接种，30℃、180r/min振荡培养72h。进一步的，所述步骤(2)具体为：取发酵液用离心机8000rpm离心10min，弃沉淀，保留上清液。进一步的，所述步骤(3)具体为：上清液加入等体积乙酸乙酯充分萃取三次，合并有机相，旋转蒸发浓缩，得到乙酸乙酯粗提物。膏状粗提物通过中压制备色谱法进行粗分离，色谱柱填料为硅胶粉，流动相为石油醚/乙酸乙酯和二氯甲烷/甲醇，经高效液相色谱法检测合并含嘌呤组分。进一步的，所述步骤(4)具体为：利用制备型高效液相色谱仪对中压制备后获得的含嘌呤组分进行分离和制备，色谱柱为HypersilBDSC8(10mmx250mm，10μm)，流动相为5％甲醇水，流速2mL/min，检测波长为222nm，样品进样浓度为70mg/mL，进样量60μL。本专利技术同时请求保护上述制备方法获得的嘌呤化合物。该化合物具体结构如式Ⅰ所示：本专利技术有益效果如下：(1)本专利技术嘌呤的制备过程简单易操作，发酵周期短、发酵成本低廉、发酵液易处理、制备方便等特点。(2)本专利技术的有益效果在于解决了嘌呤化合物的化学合成操作方法繁琐，反应副产物多，且不易分离纯化的缺点。(3)本专利技术提供了一种从海洋芽孢杆菌Bacillussp.JIN118的代谢产物中制备嘌呤的新方法，具有发酵周期短、发酵成本低廉、发酵液易处理、制备方便等特点。有效解决了嘌呤化合物合成反应过程中副产物多，不易分离纯化的技术问题。本专利技术中海洋芽孢杆菌Bacillussp.JIN118稳定生产嘌呤，且制备方法达到了快速且有效获得嘌呤的目的，纯度达95％，为今后制备具有较强抑菌作用及抗肿瘤活性的嘌呤类似物提供原材料，具有广泛的工业应用价值。附图说明图1为本专利技术菌株JIN118的系统发育树；图2为本专利技术纯品化合物的HPLC检测结果；图3为本专利技术纯品化合物的HPLC纯度检测结果；图4为本专利技术嘌呤化合物的质谱；图5为本专利技术嘌呤化合物的氢谱；图6为本专利技术嘌呤化合物的碳谱。具体实施方式下面通过具体实施例详述本专利技术，但不限制本专利技术的保护范围。如无特殊说明，本专利技术所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。本专利技术的海洋芽孢杆菌Bacillussp.JIN118已提交保藏，具体保藏信息如下：保藏编号：CCTCCNO：M2019988；保藏日期：2019年12月2日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国武汉武汉大学。实施例116SrDNA序列分析使用无菌接种环挑取单菌落于装有10μL无菌超纯水的PCR管中，混匀，100℃煮沸5min，4℃冷却5min，吸取4μL上清液作为PCR扩增的DNA模板，按照表1中50μL体系加入所需试剂，表2条件进行PCR扩增。PCR扩增产物进行核酸电泳和测序，将菌株JIN118的16SrDNA的序列(1460bp)在NCBI核酸数据库中通过BLAST进行分析并绘制系统发育树，结果如图1所示。经分析可以确定该菌株为芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌，命名为Bacillussp.JIN118。表1PCR反应体系(50μL)表2PCR反应条件实施例2嘌呤化合物的分离纯化(1)海洋芽孢杆菌Bacillussp.JIN118的活化和发酵从-80℃取出冻干保存管，接种到试管斜面，培养温度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种海洋芽孢杆菌Bacillus sp.JIN118发酵生产嘌呤的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)将海洋芽孢杆菌Bacillus sp.JIN118进行活化并发酵，得到发酵液；/n(2)对发酵液进行离心处理，弃菌体，得到上清；/n(3)上清液加入等体积的乙酸乙酯萃取，萃取液通过中压制备色谱法进行初级分离，得到粗品；/n(4)将粗品利用制备型高效液相色谱分离获得嘌呤纯品。/n

【技术特征摘要】
20190918 CN 20191088216441.一种海洋芽孢杆菌Bacillussp.JIN118发酵生产嘌呤的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将海洋芽孢杆菌Bacillussp.JIN118进行活化并发酵，得到发酵液；
(2)对发酵液进行离心处理，弃菌体，得到上清；
(3)上清液加入等体积的乙酸乙酯萃取，萃取液通过中压制备色谱法进行初级分离，得到粗品；
(4)将粗品利用制备型高效液相色谱分离获得嘌呤纯品。


2.根据权利要求1所述的一种海洋芽孢杆菌Bacillussp.JIN118发酵生产嘌呤的制备方法，其特征在于，海洋芽孢杆菌Bacillussp.JIN118活化和发酵过程是：从-80℃取出冻干保存管，接种到试管斜面，培养温度30℃，时间为16-24h，再从试管斜面挑去少量菌体接种至装有种子培养液的三角瓶中，于30℃，180r/min摇床振荡培养24h，然后按照5％的接种量接种至装有发酵培养基的三角瓶中，30℃，180r/min培养72h。


3.根据权利要求1所述的一种海洋芽孢杆菌Bacillussp.JIN118发酵生产嘌呤的制备方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：权春善，刘宝全，金梅姝，陈苛蒙，刘佳璐，金黎明，俞勇，
申请(专利权)人：大连民族大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21