本发明专利技术公开了一种对植物P450进行理性设计，提高其催化活性以及催化的区域选择性和化学选择性，从而特异性地或高效地合成目标产物的方法。利用该方法分别实现了五种稀有甘草三萜类化合物在酵母中的合成，包括甘草次酸、30‑OH‑11‑oxo‑β‑香树脂醇、29‑OH‑11‑oxo‑β‑香树脂醇、甘草次醛的特异性合成，以及11‑脱氧‑甘草次酸的高效合成。解决了当前酵母合成11‑脱氧‑甘草次酸效率低，且无法特异性合成甘草次酸、高价值甘草次酸中间体与其相应的其同分异构体的问题，从而有效地解决植物P450催化杂泛性导致的多种结构类似物同时积累而难以分离纯化的问题。
【技术实现步骤摘要】
酿酒酵母可控氧化高效合成稀有甘草三萜的方法
：本方法涉及一种控制P450催化的区域选择性、催化活性以及控制P450反应进程来特异性的合成稀有甘草三萜类化合物如甘草次酸、甘草次醛、甘草次醇(30-OH-11-oxo-β-香树脂醇)、29-OH-11-oxo-β-香树脂醇、11-脱氧-甘草次酸等三萜类化合物的方法，属于生物工程与生物化工领域。技术背景：目前已经报道的甘草三萜类化合物的生产方式主要为植物提取法。这种方法普遍存在无法绿色可持续发展的问题：提取过程使用大量的酸与碱，步骤繁琐、提取效率低、成本高和有机试剂使用量大，造成严重的环境污染。由于三萜类化合物在甘草中积累量较低且仅在根部积累，因此提取甘草次酸等化合物需要大量采挖甘草根茎，对固沙固土植被造成严重的破坏，使生态环境急剧恶化。国务院于2000年出台政策禁止滥挖野生甘草，而人工种植的甘草需要经过三年甚至更长时间的栽培才能获得适合工业生产的甘草酸含量，但其稀有三萜类化合物的含量仍然很低以至于难以提取。此外，甘草种植除需要占用大量耕地，还面临不可控的气候因素的威胁。这些因素都严重限制了甘草次酸及其它稀有三萜类化合物的生产。仅仅依靠甘草根提取已远远不能满足医药、保健和食品等领域对甘草次酸及其衍生物的需求，因此，寻求获取甘草三萜类化合物的新方法、替代与弥补当前甘草资源紧缺的现状，实现可持续发展具有非常重要的现实意义。利用可再生糖质原料，通过微生物发酵来生产植物三萜类化合物的生产方式，可以很好的替代和补充天然产物植物提取生产方式的不足。目前，虽然已成功地利用微生物尤其是酵母合成一些甘草三萜类化合物，但是依然有许多瓶颈需要解决，其中最主要的瓶颈就是许多植物来源的三萜合成相关的P450在微生物体内表现出较弱的催化活性和催化杂泛性，导致三萜产量较低并伴随有一些结构类似的副产物，合成通量下降、目标产物产量低，分离困难，难以实现工业化。而且，对于如何控制P450的催化进程，特异性的合成特定的甘草三萜类化合物尚未得到相关技术研究。为解决这一技术瓶颈，本研究对来自甘草的P450酶CYP72A63进行改造，提高了其催化的区域选择性和催化活性，通过精细控制其氧化进程实现了甘草次酸、甘草次醛、甘草次醇、29-OH-11-oxo-β-香树脂醇11-脱氧-甘草次酸等稀有三萜化合物的特异性合成。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种提高植物P450区域选择性的方法。本专利技术的第二个目的是提供一种提高植物P450催化活性的方法。本专利技术的第三个目的是提供一种控制植物P450氧化进程的方法。本专利技术的第四个目的是获得特异性地并且具有高效连续氧化11-oxo-β-香树脂醇C-30合成甘草次酸的CYP72A63突变体。本专利技术的第五个目的是获得其与相应的野生型CYP72A63蛋白相比，具有显著提高的β-香树脂醇C-30氧化合成11-脱氧-甘草次酸的突变体。本专利技术的第六个目的是可使其连续氧化过程停留在30-OH-11-oxo-β-香树脂醇，从而特异性地合成30-OH-11-oxo-β-香树脂醇的突变体。本专利技术的第七个目的是获得其与相应的野生型CYP72A63蛋白相比，具有特异性的对11-oxo-β-香树脂醇C-29羟化活性的突变体。本专利技术的第八个目的是获得一种利用酿酒酵母能够特异性合成甘草次醛的方法。本专利技术的第九个目的是利用酿酒酵母实现11-脱氧-甘草次酸的高效合成。附图说明：图1野生型CYP72A63氧化11-oxo-β-香树脂醇产物的TIC色谱图图2突变体CYP72A63(T338S)氧化11-oxo-β-香树脂醇产物的TIC色谱图图3硅烷化衍生后的甘草次酸质谱图图4突变体CYP72A63(L398I)氧化11-oxo-β-香树脂醇的TIC色谱图图5硅烷化衍生后的30-OH-11-oxo-β-香树脂醇质谱图图6将CYP72A63(T338S)与GuCPR2匹配后，氧化11-oxo-β-香树脂醇的TIC色谱图图7硅烷化衍生后的甘草次醛质谱图图8突变体CYP72A63(L509I)氧化11-oxo-β-香树脂醇的TIC色谱图图9硅烷化衍生后的29-OH-11-oxo-β-香树脂醇质谱图技术方案概述如下：通过同源建模对其三维结构进行模拟。利用已报道的CYP4B1的X射线晶体结构作为同源蛋白质模板，通过在线工具SWISS-MODEL(http://www.swissmodel.expasy.org)对CYP72A63的进行同源建模。使用AutoDock1.5.6进行分子对接模拟，分别导入CYP72A63和11-oxo-β-香树脂醇的结构文件，通过对对接结果进行分析，预测突变位点。通过定点突变的方法构建突变体，并将突变体在酵母体内进行功能验证。功能验证的方法如下：1、一种β-香树脂醇合酶，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示2、Uni25647，一种β-香树脂醇C-11氧化酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.23、β-香树脂醇合酶表达盒的构建：将上游同源序列，启动子、香树脂醇合酶基因、终止子通过吉布森组装构建表达盒4、Uni25647表达盒构建：将同源序列，启动子、Uni25647、终止子通过吉布森组装构建表达盒5、CYP72A63突变体表达盒构建：将同源序列，启动子、CYP72A63突变体、终止子通过吉布森组装构建表达盒6、CPR表达和构建：将同源序列，启动子、GuCPR1或AtCPR1或MtCPR2或MtCPR3或GuCPR2、终止子通过吉布森组装构建表达盒7、筛选标记表达盒构建：将同源序列，启动子、筛选标记、终止子通过吉布森组装构建表达盒8、工程酵母的构建：将所得表达盒共转化到酿酒酵母，使其整合到酵母基因组，构建带有功能性CYP72A63突变体的工程酵母。利用所得突变体构建工程酵母菌株使其具有能够特异性生产甘草次酸、甘草次醇、甘草次醛、29-OH-11-oxo-β-香树脂醇的特性。本专利技术为调控P450氧化过程及特异性的合成甘草次酸、甘草次醇、甘草次醛、29-OH-11-oxo-β-香树脂醇提供了一种切实可行的方法。下面结合具体实施例，对本专利技术作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而非用于限制本专利技术的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1：CYP72A63同源建模及分子对接由于CYP72A63没有晶体结构，因此需通过同源建模对其三维结构进行模拟。利用已报道的CYP4B1的X射线晶体结构作为同源蛋白质模板，通过在线工具SWISS-MODEL(http://www.swissmodel.expasy.org)对CYP72A63的进行同源建模。使用AutoDock1.5.6进行分子对接模拟，分别导入CYP72A63和11-oxo-β-香本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.可控合成稀有甘草三萜的CYP72A63蛋白突变体，其中稀有甘草三萜包括甘草次酸、甘草次醛、30-OH-11-oxo-β-香树脂醇、29-OH-11-oxo-β-香树脂醇以及11-脱氧-甘草次酸。/n
【技术特征摘要】
1.可控合成稀有甘草三萜的CYP72A63蛋白突变体，其中稀有甘草三萜包括甘草次酸、甘草次醛、30-OH-11-oxo-β-香树脂醇、29-OH-11-oxo-β-香树脂醇以及11-脱氧-甘草次酸。
2.根据权利要求1所述的突变体，突变体CYP72A63(T338S)其氨基酸序列如SEQIDNO.5所示、CYP72A63(T338S/W205A)其氨基酸序列如SEQIDNO.6所示,与相应的野生型CYP72A63蛋白相比具有显著提高11-oxo-β-香树脂醇C-30氧化活性和特异性，从而显著提高甘草次酸合成的特异性和效率。
3.根据权利要求1所述的突变体，突变体CYP72A63(T338S)其氨基酸序列如SEQIDNO.5所示、CYP72A63(T338S/W205A)其氨基酸序列如SEQIDNO.6所示,与相应的野生型CYP72A63蛋白相比具有显著提高的β-香树脂醇C-30氧化活性，从而显著提高11-脱氧-甘草次酸合成能力。
4.根据权利要求1所述的突变体，突变体CYP72A63(L509I)其氨基酸序列如其氨基酸序列如SEQIDNO.7所示、CYP72A63(L242I)其氨基酸序列如SEQIDNO.8所示，与相应的野生型CYP72A63蛋白相比，可...
【专利技术属性】
技术研发人员：李春，孙文涛，薛海洁，王颖，吕波，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。